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wh6125

铁虫 (初入文坛)

[求助] 设计了简并引物,PCR扩不出条带

本人欲克隆一条未知基因,从NCBI上下了几条其他物种上的该基因,应用CODEHOP结合Block Maker设计了几条简并引物,都没有扩出条带。首先确定cDNA是没问题的,已经用Actin验证过;PCR也用了不同的退火温度,还是不出条带。。。那是说明引物的问题了吧,但是真的不知道怎么设计引物了,郁闷死了,有没有高手能帮忙设计引物,或者指点一下也可以,谢谢~~
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
2楼2013-11-01 08:32:11
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lyqifeih

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wh6125: 金币+5, 有帮助 2013-11-01 09:18:10
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-05 11:49:53
您的简并引物有几个不确定的碱基。做不出来原因很多,很多时候是目的引物浓度不够,我以前加了4个,用10uM引物P不出来,后来引物浓度提高10~100倍慢慢就能看到条带。
刚进入神经生物和电生理
3楼2013-11-01 08:49:59
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lyqifeih at 2013-11-01 08:49:59
您的简并引物有几个不确定的碱基。做不出来原因很多,很多时候是目的引物浓度不够,我以前加了4个,用10uM引物P不出来,后来引物浓度提高10~100倍慢慢就能看到条带。

我问过一个师兄,他说有可能是引物浓度太高,导致引物不能结合模板,PCR中只扩增引物,导致引物条带特别亮。。。这个是应该降低引物浓度还是提高呢?
4楼2013-11-01 09:17:35
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lyqifeih

新虫 (小有名气)

你用什么酶扩增的,普通的Taq聚合酶会存在这个问题,我一般都用hotstart DNA 聚合酶,避免引物扩增。
刚进入神经生物和电生理
5楼2013-11-01 09:27:34
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lyqifeih at 2013-11-01 09:27:34
你用什么酶扩增的,普通的Taq聚合酶会存在这个问题,我一般都用hotstart DNA 聚合酶,避免引物扩增。

我就用的普通的Mix,设置了各种梯度什么的,引物浓度也试了还是不行,要不也试试这个Hot start,看到Takara有这种Mix
6楼2013-11-04 19:03:54
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7楼2015-05-04 15:45:55
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竹砚

铜虫 (小有名气)

楼主实验成功了吗?我最近也在试简并引物,用的文献中的引物,但没扩增出来,现在也在自己试着设
记得心中的那个梦。
8楼2015-09-29 16:43:16
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andywang6137

木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 竹砚 at 2015-09-29 16:43:16
楼主实验成功了吗?我最近也在试简并引物,用的文献中的引物,但没扩增出来,现在也在自己试着设

你用的是codehop设计的简并引物不?结果怎么样?
9楼2015-10-26 17:46:07
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羽化姚俊鹏

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-10-25 21:46:07
你用的是codehop设计的简并引物不?结果怎么样?...

冒昧问一下,进行blockmake的氨基酸序列,您是怎么选择的?
志同道合
10楼2016-08-11 16:36:12
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