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wh6125

铁虫 (初入文坛)

[求助] 设计了简并引物，PCR扩不出条带

本人欲克隆一条未知基因，从NCBI上下了几条其他物种上的该基因，应用CODEHOP结合Block Maker设计了几条简并引物，都没有扩出条带。首先确定cDNA是没问题的，已经用Actin验证过；PCR也用了不同的退火温度，还是不出条带。。。那是说明引物的问题了吧，但是真的不知道怎么设计引物了，郁闷死了，有没有高手能帮忙设计引物，或者指点一下也可以，谢谢~~
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1楼 2013-10-31 10:53:45
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
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2楼2013-11-01 08:32:11
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lyqifeih

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wh6125: 金币+5, ★有帮助 2013-11-01 09:18:10
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:49:53
您的简并引物有几个不确定的碱基。做不出来原因很多，很多时候是目的引物浓度不够，我以前加了4个，用10uM引物P不出来，后来引物浓度提高10~100倍慢慢就能看到条带。
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刚进入神经生物和电生理
3楼2013-11-01 08:49:59
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wh6125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyqifeih at 2013-11-01 08:49:59
您的简并引物有几个不确定的碱基。做不出来原因很多，很多时候是目的引物浓度不够，我以前加了4个，用10uM引物P不出来，后来引物浓度提高10~100倍慢慢就能看到条带。

我问过一个师兄，他说有可能是引物浓度太高，导致引物不能结合模板，PCR中只扩增引物，导致引物条带特别亮。。。这个是应该降低引物浓度还是提高呢？
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4楼2013-11-01 09:17:35
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lyqifeih

新虫 (小有名气)
你用什么酶扩增的，普通的Taq聚合酶会存在这个问题，我一般都用hotstart DNA 聚合酶，避免引物扩增。
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刚进入神经生物和电生理
5楼2013-11-01 09:27:34
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wh6125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lyqifeih at 2013-11-01 09:27:34
你用什么酶扩增的，普通的Taq聚合酶会存在这个问题，我一般都用hotstart DNA 聚合酶，避免引物扩增。

我就用的普通的Mix，设置了各种梯度什么的，引物浓度也试了还是不行，要不也试试这个Hot start，看到Takara有这种Mix
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6楼2013-11-04 19:03:54
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留着作为
7楼2015-05-04 15:45:55
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竹砚

铜虫 (小有名气)
楼主实验成功了吗？我最近也在试简并引物，用的文献中的引物，但没扩增出来，现在也在自己试着设
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记得心中的那个梦。
8楼2015-09-29 16:43:16
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andywang6137

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 竹砚 at 2015-09-29 16:43:16
楼主实验成功了吗？我最近也在试简并引物，用的文献中的引物，但没扩增出来，现在也在自己试着设

你用的是codehop设计的简并引物不？结果怎么样？
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9楼2015-10-26 17:46:07
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羽化姚俊鹏

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-10-25 21:46:07
你用的是codehop设计的简并引物不？结果怎么样？...

冒昧问一下，进行blockmake的氨基酸序列，您是怎么选择的？
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志同道合
10楼2016-08-11 16:36:12
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