应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 设计了简并引物，PCR扩不出条带
101/1返回列表
查看: 3528  |  回复: 9
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wh6125

铁虫 (初入文坛)

[求助] 设计了简并引物，PCR扩不出条带

本人欲克隆一条未知基因，从NCBI上下了几条其他物种上的该基因，应用CODEHOP结合Block Maker设计了几条简并引物，都没有扩出条带。首先确定cDNA是没问题的，已经用Actin验证过；PCR也用了不同的退火温度，还是不出条带。。。那是说明引物的问题了吧，但是真的不知道怎么设计引物了，郁闷死了，有没有高手能帮忙设计引物，或者指点一下也可以，谢谢~~
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

感兴趣的

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-10-31 10:53:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2013-11-01 08:32:11
 已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

lyqifeih

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wh6125: 金币+5, ★有帮助 2013-11-01 09:18:10
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:49:53
您的简并引物有几个不确定的碱基。做不出来原因很多，很多时候是目的引物浓度不够，我以前加了4个，用10uM引物P不出来，后来引物浓度提高10~100倍慢慢就能看到条带。
赞一下 回复此楼
刚进入神经生物和电生理
3楼2013-11-01 08:49:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wh6125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyqifeih at 2013-11-01 08:49:59
您的简并引物有几个不确定的碱基。做不出来原因很多，很多时候是目的引物浓度不够，我以前加了4个，用10uM引物P不出来，后来引物浓度提高10~100倍慢慢就能看到条带。

我问过一个师兄，他说有可能是引物浓度太高，导致引物不能结合模板，PCR中只扩增引物，导致引物条带特别亮。。。这个是应该降低引物浓度还是提高呢？
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-01 09:17:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyqifeih

新虫 (小有名气)
你用什么酶扩增的，普通的Taq聚合酶会存在这个问题，我一般都用hotstart DNA 聚合酶，避免引物扩增。
赞一下 回复此楼
刚进入神经生物和电生理
5楼2013-11-01 09:27:34
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wh6125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lyqifeih at 2013-11-01 09:27:34
你用什么酶扩增的，普通的Taq聚合酶会存在这个问题，我一般都用hotstart DNA 聚合酶，避免引物扩增。

我就用的普通的Mix，设置了各种梯度什么的，引物浓度也试了还是不行，要不也试试这个Hot start，看到Takara有这种Mix
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-11-04 19:03:54
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

留着作为
7楼2015-05-04 15:45:55
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

竹砚

铜虫 (小有名气)
楼主实验成功了吗？我最近也在试简并引物，用的文献中的引物，但没扩增出来，现在也在自己试着设
赞一下 回复此楼
记得心中的那个梦。
8楼2015-09-29 16:43:16
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andywang6137

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 竹砚 at 2015-09-29 16:43:16
楼主实验成功了吗？我最近也在试简并引物，用的文献中的引物，但没扩增出来，现在也在自己试着设

你用的是codehop设计的简并引物不？结果怎么样？
赞一下 回复此楼
9楼2015-10-26 17:46:07
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

羽化姚俊鹏

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by andywang6137 at 2015-10-25 21:46:07
你用的是codehop设计的简并引物不？结果怎么样？...

冒昧问一下，进行blockmake的氨基酸序列，您是怎么选择的？
赞一下 回复此楼
志同道合
10楼2016-08-11 16:36:12
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wh6125 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭