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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 测序正确的片段双酶切连接表达载体，提质粒PCR验证后，还需要再次测序吗？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[交流] 测序正确的片段双酶切连接表达载体，提质粒PCR验证后，还需要再次测序吗？

我做的是表达，照理应该测序确定一下，不过之前对双酶切太信任了，我切胶回收又从来不用紫外，都是肉眼看着徒手切。感觉没有什么能让片段变化的因素。
  但是最近单酶切的一个样品送去测序，连的片段已经测序正确了，pcr鉴定用的是上游特异性引物，下游通用引物，pcr条带大小正确，但是测序居然连反了……而且末端有三个单点突变……突变可能是测序错误，我一看反了也没有再细看。但是连反了是什么鬼！
  我还有六个样品，是双酶切连接的，在克隆载体上测序正确，然后连了表达载体，提质粒pcr鉴定，上下游引物分别是特异性引物和通用引物，条带大小正常，而且每个样挑的三个单克隆条带大小相同。这是不是意味着这三个样我可以随便用呢？网上没有关于这个的讨论，我心里挺没底的，做过的同学都来说一说吧。
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1楼 2015-04-07 11:29:54
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流氓一个

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单酶切确实有连反的可能啊
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我有我人生
4楼2015-04-08 08:33:32
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:24:43
双酶切的话除非你的质粒酶切位点反了，否则不可能反向。你的测序是不是用反向引物测的？反向引物测序话序列是反向的。
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。
2楼2015-04-07 12:16:22
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-04-07 12:16:22
双酶切的话除非你的质粒酶切位点反了，否则不可能反向。你的测序是不是用反向引物测的？反向引物测序话序列是反向的。

我的片段3000，所以都是双向测序再拼接的

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2015-04-07 16:04:42
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xiaochong8693

木虫之王 (文坛精英)
祝你一切顺利，努力加油，心想事成，好梦成真！
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5楼2015-04-08 09:16:19
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