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ggyy0911铁虫 (正式写手)
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[交流]
测序正确的片段双酶切连接表达载体，提质粒PCR验证后，还需要再次测序吗？
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我做的是表达，照理应该测序确定一下，不过之前对双酶切太信任了，我切胶回收又从来不用紫外，都是肉眼看着徒手切。感觉没有什么能让片段变化的因素。 但是最近单酶切的一个样品送去测序，连的片段已经测序正确了，pcr鉴定用的是上游特异性引物，下游通用引物，pcr条带大小正确，但是测序居然连反了……而且末端有三个单点突变……突变可能是测序错误，我一看反了也没有再细看。但是连反了是什么鬼！ 我还有六个样品，是双酶切连接的，在克隆载体上测序正确，然后连了表达载体，提质粒pcr鉴定，上下游引物分别是特异性引物和通用引物，条带大小正常，而且每个样挑的三个单克隆条带大小相同。这是不是意味着这三个样我可以随便用呢？网上没有关于这个的讨论，我心里挺没底的，做过的同学都来说一说吧。 |
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