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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 构建载体PCR结果和测序结果不一样
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海底刚琴

银虫 (小有名气)

[求助] 构建载体PCR结果和测序结果不一样已有3人参与

最近构建了一个克隆载体，目的基因2000多bp插入到pCMV载体上，在培养基上挑了单克隆 ,摇菌提质粒，用目的基因的上下游引物去pcr质粒，跑胶有2000多的条带出现，之后将质粒送去测序，使用通用引物，测通，结果却是只有1000左右的序列，而且和目的基因不能匹配。重复俩次，结果都是这样，两次测序结果只有下游两三个碱基不一样其他都一样。出现这种情况让我想不通，希望大家能帮助一下，给个合理的解释。
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生活总是有那么多门槛，一口气跨过去就好了。
1楼2015-04-06 18:32:04
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人车

木虫 (正式写手)
我现在也是出现了这样的问题 我的PCR产物开始送出去测序比对是正确的 但是之后重组质粒连接 转化之后做菌落PCR用的是我的特异性引物以及载体的通用引物也都出来目的基因大小的片段 不过送出去测序就是细碎 我现在也想不通 准备再找一个测序公司试一下 想问一下 楼主找出问题在哪里了吗？
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2楼2015-04-08 10:52:10
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:25:37
由于测序结果只有800 bp左右序列是准确可信的，所以一般测序公司只给出1000 bp左右的测序结果，要想测通，可以向测序公司提出或者自己在中间设计引物，引物序列提供给测序公司，要求合成并用通用引物及特异引物多次测序，从而拼接出正确序列，此外还需要加大送样量。
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没有做不到，只有想不到！
3楼2015-04-08 11:17:09
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:25:46
楼主如果描述问题没有错误的话，感觉是你自己的特异性引物污染了，可以做一下无模板对照看看有没有条带。建议你用通用引物上游和特异性引物下游鉴定你的结果。测序可能性也有，很小。
实在不行就直接送PCR产物吧，带要纯！
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4楼2015-04-08 19:42:43
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果确定是收到的拼接结果的话只能是前期构建的问题了。。。。。。。建议将质粒PCR的产物送去测序，一步步缩小范围一一排查
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5楼2015-05-10 16:51:28
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