应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 构建载体PCR结果和测序结果不一样
51/1返回列表
查看: 1906  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

海底刚琴

银虫 (小有名气)

[求助] 构建载体PCR结果和测序结果不一样 已有3人参与

最近构建了一个克隆载体，目的基因2000多bp插入到pCMV载体上，在培养基上挑了单克隆 ,摇菌提质粒，用目的基因的上下游引物去pcr质粒，跑胶有2000多的条带出现，之后将质粒送去测序，使用通用引物，测通，结果却是只有1000左右的序列，而且和目的基因不能匹配。重复俩次，结果都是这样，两次测序结果只有下游两三个碱基不一样其他都一样。出现这种情况让我想不通，希望大家能帮助一下，给个合理的解释。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
生活总是有那么多门槛，一口气跨过去就好了。
1楼 2015-04-06 18:32:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

人车

木虫 (正式写手)
我现在也是出现了这样的问题 我的PCR产物开始送出去测序比对是正确的 但是之后重组质粒连接 转化之后做菌落PCR用的是我的特异性引物以及载体的通用引物也都出来目的基因大小的片段 不过送出去测序就是细碎 我现在也想不通 准备再找一个测序公司试一下 想问一下 楼主找出问题在哪里了吗？
赞一下 回复此楼
2楼2015-04-08 10:52:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:25:37
由于测序结果只有800 bp左右序列是准确可信的，所以一般测序公司只给出1000 bp左右的测序结果，要想测通，可以向测序公司提出或者自己在中间设计引物，引物序列提供给测序公司，要求合成并用通用引物及特异引物多次测序，从而拼接出正确序列，此外还需要加大送样量。
赞一下(1人) 回复此楼
没有做不到，只有想不到！
3楼2015-04-08 11:17:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-09 08:25:46
楼主如果描述问题没有错误的话，感觉是你自己的特异性引物污染了，可以做一下无模板对照看看有没有条带。建议你用通用引物上游和特异性引物下游鉴定你的结果。测序可能性也有，很小。
实在不行就直接送PCR产物吧，带要纯！
赞一下 回复此楼
4楼2015-04-08 19:42:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果确定是收到的拼接结果的话只能是前期构建的问题了。。。。。。。建议将质粒PCR的产物送去测序，一步步缩小范围一一排查
赞一下 回复此楼
5楼2015-05-10 16:51:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 海底刚琴 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 rFEsUBKXRll0 2026-09-02 7/350 2026-09-03 22:22 by MaGEwsTzjTkD
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ero8OE6tv9cu 2026-09-02 5/250 2026-09-03 22:20 by MaGEwsTzjTkD
[硕博家园] 哈尔滨工业大学韩晓军教授课题组招收2027年硕士推免生及博士研究生 +3 灯灯灯灯DDDD 2026-09-03 3/150 2026-09-03 21:22 by 科研皮皮猪
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 YLHlRHNwYkce 2026-09-02 8/400 2026-09-03 20:40 by jyNB2vrbdUpR
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 YLHlRHNwYkce 2026-09-02 8/400 2026-09-03 20:31 by jyNB2vrbdUpR
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 uFOAtb1CDngh 2026-09-02 9/450 2026-09-03 20:20 by jyNB2vrbdUpR
[考博] 找导师 +7 yuanjiabao 2026-08-29 8/400 2026-09-03 20:15 by yinnelly
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ero8OE6tv9cu 2026-09-02 5/250 2026-09-03 20:09 by jyNB2vrbdUpR
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ero8OE6tv9cu 2026-09-02 9/450 2026-09-03 20:07 by jyNB2vrbdUpR
[基金申请] 面上没中，邀请各位路过的虫友分析一下分数 +3 jackleilei 2026-09-03 3/150 2026-09-03 19:13 by god_tian
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 YLHlRHNwYkce 2026-09-02 11/550 2026-09-03 18:42 by jyNB2vrbdUpR
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ero8OE6tv9cu 2026-09-02 5/250 2026-09-03 16:38 by T0rGB46095mJ
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 YLHlRHNwYkce 2026-09-02 8/400 2026-09-03 12:03 by T0rGB46095mJ
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题 +7 瞬息宇宙 2026-09-01 14/700 2026-09-02 17:33 by ma0526
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +5 瞬息宇宙 2026-08-31 5/250 2026-09-02 10:13 by 雨冰共舞
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭