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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求指导！要测序，长度为1500左右，是pcr产物直接测序好还是连接转化测序比较好？
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aounao

新虫 (初入文坛)

[求助] 求指导！要测序，长度为1500左右，是pcr产物直接测序好还是连接转化测序比较好？ 已有4人参与

是对一个细菌测序，测序结果就是用来做分析，是从各个地方取样来分析序列，分析dna的多样性，构建系统发育树等等，是直接用pcr产物测序好还是连接转化比较好？
如果用pcr产物测序的话，是不是必须要提取dna来跑pcr，因为之前测序是做的菌液pcr然后连接转化等等。
谢谢师兄师姐的知道！
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1楼 2014-10-09 17:43:55
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aounao

新虫 (初入文坛)
怎么木有人。。。。
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2楼2014-10-09 19:01:46
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Merrylegs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-10 12:27:14
一般来说用质粒或含质粒的菌液测序，效果要比PCR测序好。
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3楼2014-10-09 19:09:49
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aounao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Merrylegs at 2014-10-09 19:09:49
一般来说用质粒或含质粒的菌液测序，效果要比PCR测序好。

谢谢你！
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4楼2014-10-10 09:26:49
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-10 12:27:18
这要看你想要的结果了，如果你要求1500 bp序列全部准确的话，需要克隆到载体上然后采用通用引物进行正反向测序；如果你要求只是中间一段是准确的话，可以对PCR产物进行测序。
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rainwater
5楼2014-10-10 10:18:12
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-10 12:27:21
pcr产物不一定纯，有可能有杂条带。转化后的菌液测序当让是最好的，因为没有杂质啦。洗完对你有帮助
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6楼2014-10-10 10:48:46
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-10 12:27:25
aounao: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-10-10 12:56:59
最好是质粒或含质粒的菌液测序，这样可以测到较为准确的全长序列，另外看你的目的基因多态性区域，如果在中间也可以PCR产物测序，但是PCR扩增需用保真性高的酶，否则也会有错配。小建议，仅供参考。
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7楼2014-10-10 12:02:06
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qiqi_mother

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

kx444555: 鼓励交流 2014-10-10 12:27:29
有些细菌是可以直接菌落或菌液PCR的，无需提取DNA，如E. Coli, 蓝藻，酵母等等。
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8楼2014-10-10 12:08:27
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linfujian

金虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:13:40
提取细菌DNA然后用特异性强的引物PCR就行，保证PCR后跑胶只有一条特亮的目的条带。然后再送测序。这样对于你的多样品来说方便快捷。
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9楼2014-10-13 09:18:00
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王冠傑

铁虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:13:48
1500bp一般双向就能测出来，不知道您对于序列要求高不高，因为测序前50bp会存在不准确的情况。如果要求比较高的话建议构建克隆（建议您用PMD18-T，这个成功率较高，千万不要用PET）用通用引物测序，如果要求不高的话直接送PCR产物好了，这样省钱。通常质粒的成功率要比PCR产物高！当然送测之前做一个酶切鉴定就最好了。不鉴定也行，一般的测序公司都能根据测序结果分析出你的问题的，就是耽搁一些时间。
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10楼2014-11-25 21:25:38
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