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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物异常，空白对照出现条带，求解！
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] PCR产物异常，空白对照出现条带，求解！ 已有3人参与

做RT-PCR，模板是一样的，前面三个样是一对引物，后面三个样品是另外一对引物，最后一个加的是水做空白对照（从左至右）。根据Genebank上的序列，第一对引物的目的条带应该是1400bp，第二对为1000bp左右，marker是1500bp，得到的条带均为500bp，这两对引物扩增的基因是纤维素酶基因中的内切葡聚糖酶EG I和EG III,算是属于同一个酶系。
     很是奇怪，不知道是什么原因？往各位大神分析分析。听说cDNA作为模板进行PCR，因为内含子的原因，扩增的长度比预期的短是有可能的，可是为什么引物不同条带大小却是一样的呢？怎么空白对照也有条带呢？求助！不胜感激！

PCR产物异常，空白对照出现条带，求解！
UVP00209Jan212015_副本.jpg
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
1楼 2015-01-21 18:00:51
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-21 20:59:41
连水都P出来带了，而且7个泳道几乎无差异大小一样亮度一样，这说明你的PCR体系出问题了，最好是一项一项排除，包括水，dNTP，buffer，你看你6个样品泳道拖尾都拖到月球上去了，降低模板量试试看，另外重新设计引物是最后的计策。
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2楼2015-01-21 18:41:00
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
妥妥的，你PCR的试剂污染了，连带引物一起换新的吧，（用另一对引物试试。）PCR的试剂可以用TAKELA的一步法试剂盒，连带反转录都是一步的，2000多块，25UL体系可以用200次，我们这做病毒已经用了快三年了，质量值得信赖。楼主的片段有500，那肯定不是引物二聚体了，测序看看，估计是P出来了。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-01-22 10:50:59
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-22 10:50:59
妥妥的，你PCR的试剂污染了，连带引物一起换新的吧，（用另一对引物试试。）PCR的试剂可以用TAKELA的一步法试剂盒，连带反转录都是一步的，2000多块，25UL体系可以用200次，我们这做病毒已经用了快三年了，质量值得 ...

这玩意儿太贵老板肯定不会给买，我能直接回收么？
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
4楼2015-01-22 14:01:54
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
2楼: Originally posted by ptttmt at 2015-01-21 18:41:00
连水都P出来带了，而且7个泳道几乎无差异大小一样亮度一样，这说明你的PCR体系出问题了，最好是一项一项排除，包括水，dNTP，buffer，你看你6个样品泳道拖尾都拖到月球上去了，降低模板量试试看，另外重新设计引物是 ...

体系改为25ul，换了buffer和dNTP，也降低了模板量，分子量又变成700bp了，奇怪呀
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5楼2015-01-22 14:03:16
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wu-ke-da at 2015-01-22 14:03:16
体系改为25ul，换了buffer和dNTP，也降低了模板量，分子量又变成700bp了，奇怪呀...

不好说呀，反正你是批出东西来了，至于是不是目的片段，测序看看吧。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-01-22 15:09:24
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶浓度是多少？也许它们的条带是有差异的，只是因为胶浓度的原因，区别的不是很清楚，
至于空白组出现了条带，是交叉污染了（绝对是的）
如果胶浓度没有问题，那么就是整个试剂都被污染了，重换试剂盒在做一遍吧。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-01-23 10:42:40
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-23 10:42:40
胶浓度是多少？也许它们的条带是有差异的，只是因为胶浓度的原因，区别的不是很清楚，
至于空白组出现了条带，是交叉污染了（绝对是的）
如果胶浓度没有问题，那么就是整个试剂都被污染了，重换试剂盒在做一遍吧。

为了区分清楚，用的是2%的胶呢，marker不是跑得挺开的么
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
8楼2015-01-23 22:03:24
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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)
楼主问题解决了吗？我的实验也出现了这种情况，最近扩增两个完全不同的基因都出现这种状况。所有用的东西都换新的，还换了地方做了，空白还是出现条带，而且还很亮，彻底懵了
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9楼2015-05-14 09:16:59
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
9楼: Originally posted by 浣花道人 at 2015-05-14 09:16:59
楼主问题解决了吗？我的实验也出现了这种情况，最近扩增两个完全不同的基因都出现这种状况。所有用的东西都换新的，还换了地方做了，空白还是出现条带，而且还很亮，彻底懵了

一直都没有解决，最后还是换了引物才解决问题，你可以先忽略空白对照的条带，回收PCR产物，看是否能回收到目的条带。我当时是回收不到目的条带，量很大都没用，所以怀疑这个条带是假阳性的，可能根本不存在。
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
10楼2015-05-14 21:54:20
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