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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建成功后双酶切什么都没切下来是什么原因
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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建成功后双酶切什么都没切下来是什么原因 已有3人参与

我成功构建了重组载体后转到大肠保存，测序也正确，之前也做过质粒双酶切，可以切出目的条带，可是这两天从-80拿菌活化重提质粒进行双酶切后没有目的基因条带，只感觉质粒被切成了两段，两条大概都在7、8kb，我的质粒大小是9kb，目的基因大小是300多bp，双酶切体系为20微升，加了3微升质粒，酶各0.5微升，这到底是什么原因呢？
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1楼 2014-11-04 08:23:55
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dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-11-04 12:46:26
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 已经扩大体系提高质粒浓度，成功切开了 2014-11-05 10:09:56
1）质粒浓度有多高?3uL貌似有点少了，尤其对于只有300bp的小条带来说。我一般酶切40uL体系，质粒2ug以上。
2）做个菌液PCR鉴定一下。
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2楼2014-11-04 09:12:14
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 已经扩大体系提高质粒浓度，成功切开了 2014-11-05 10:10:05
不确定因素，建议先单酶切看看质粒，是不是操作失误引起的
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学习再学习，努力再努力。
3楼2014-11-04 15:53:08
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 已经扩大体系提高质粒浓度，成功切开了 2014-11-05 10:10:15
载体9K，目的片段300bp，两者的比例是30:1，这种情况下就算是能切，浓度也是需要很高的，在电泳检测时可能小片段会看不到条带，建议做个PCR验证一下是否能P出目的条带。
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4楼2014-11-04 17:14:27
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