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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建成功后双酶切什么都没切下来是什么原因 已有3人参与

我成功构建了重组载体后转到大肠保存,测序也正确,之前也做过质粒双酶切,可以切出目的条带,可是这两天从-80拿菌活化重提质粒进行双酶切后没有目的基因条带,只感觉质粒被切成了两段,两条大概都在7、8kb,我的质粒大小是9kb,目的基因大小是300多bp,双酶切体系为20微升,加了3微升质粒,酶各0.5微升,这到底是什么原因呢?
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 已经扩大体系提高质粒浓度,成功切开了 2014-11-05 10:10:15
载体9K,目的片段300bp,两者的比例是30:1,这种情况下就算是能切,浓度也是需要很高的,在电泳检测时可能小片段会看不到条带,建议做个PCR验证一下是否能P出目的条带。
4楼2014-11-04 17:14:27
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dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-11-04 12:46:26
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 已经扩大体系提高质粒浓度,成功切开了 2014-11-05 10:09:56
1)质粒浓度有多高?3uL貌似有点少了,尤其对于只有300bp的小条带来说。我一般酶切40uL体系,质粒2ug以上。
2)做个菌液PCR鉴定一下。
2楼2014-11-04 09:12:14
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
蓝色泡沫321: 金币+5, ★★★很有帮助, 已经扩大体系提高质粒浓度,成功切开了 2014-11-05 10:10:05
不确定因素,建议先单酶切看看质粒,是不是操作失误引起的
学习再学习,努力再努力。
3楼2014-11-04 15:53:08
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