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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 双酶切得到的500bp的片段回收效果不好，是怎么个情况？
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Lopick

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切得到的500bp的片段回收效果不好，是怎么个情况？ 已有6人参与

我的质粒全长3000多bp   双酶切后得到2000bp和500bp两个片段  可是前者亮度较好  后者亮度较浅    要回收500bp  可是回收后跑胶没条带   请问各位大神  这是神马情况啊？？？

双酶切得到的500bp的片段回收效果不好，是怎么个情况？
ab shuangmeiqie2014-10-23 16hr 55min_副本.jpg
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1楼 2014-11-01 21:35:50
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Lopick: 金币+1 2014-11-02 16:44:17
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-11-02 21:59:54
你可以看一下成像的原理，小片段相对大片段不亮是合理的，你可以增加以下模板的量，因为回收本来就有一定的效率，目的片段太少了，回收过程中损失太多了……
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2014-11-02 00:04:06
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Thomas_T

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Lopick: 金币+2 2014-11-02 16:44:06
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-11-02 22:00:01
小片段回收是比较麻烦，我前段时间也出现过这个问题，首先应该用试剂盒给的TE，因为TE是弱碱性的，有利于DNA的溶解，我前段时间用灭菌水要过一直不好，因为这个水有点偏酸性了。。另外，在最后一步离心下来的DNA溶液再放到柱子上离心一下，这样会提高回收率。当然了，最后加TE的时候最好60度预热一下。
祝你成功~
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3楼2014-11-02 09:53:16
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dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Lopick: 金币+1 2014-11-02 16:44:11
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-11-02 22:00:06
目测质粒浓度太低，增加酶切质粒的量是最有效的解决办法。。。
另外，我一般回收后都直接测定浓度，不再跑电泳检测的。
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4楼2014-11-02 13:07:34
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只要有就可以往下做，不必在意量。大不了下步连接全部加上

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5楼2014-11-02 16:40:58
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Lopick

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Thomas_T at 2014-11-02 09:53:16
小片段回收是比较麻烦，我前段时间也出现过这个问题，首先应该用试剂盒给的TE，因为TE是弱碱性的，有利于DNA的溶解，我前段时间用灭菌水要过一直不好，因为这个水有点偏酸性了。。另外，在最后一步离心下来的DNA溶液 ...

你好  很感谢你的答复  方便留个联系方式吗？  最近做的有点不顺利，想请教您一下。
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6楼2014-11-02 16:43:56
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289363400

铁杆木虫 (知名作家)

凌乱前进方向

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有的时候即使看不到条带也能出来结果的，多试几次看看。
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7楼2014-11-02 17:05:32
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Thomas_T

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Lopick at 2014-11-02 16:43:56
你好  很感谢你的答复  方便留个联系方式吗？  最近做的有点不顺利，想请教您一下。...

1007065296
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8楼2014-11-02 20:52:12
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-11-02 22:00:23
Lopick: 金币+1 2014-11-03 08:33:16
1、目测你的酶切好像不完全，多切点时间不急做分子实验
2、凝胶回收注意：低温核酸容易结合在柱子上，所以溶胶液可以冷却在4°冰箱2min，然后离心。
3、高温核酸易分离，所以用60°的洗脱液洗脱，那么你得到的回收率可以达到90%以上
暂时给你这么多意见吧
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9楼2014-11-02 21:57:11
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