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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » A-T克隆重组质粒筛选 菌落PCR
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)

[求助] A-T克隆重组质粒筛选 菌落PCR 已有2人参与

我使用pMD19-T对1600bp基因片段进行A-T克隆，在含有Amp的LB平板上长有少量的菌落，分别挑取半个菌落进行菌落PCR，但是电泳确认是发现所有菌落的条带均一致但都小于目的片段（小于1000bp），PCR所用试剂均没有问题以前使用过，请高手指教是哪里出现了问题，万分感谢！！！！！
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1楼 2014-08-06 18:08:01
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 23:03:59
sunyu65045: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-07 15:13:13
-你确定在基因片段两端加上3‘A了么。如果没有，可以用Taq酶加3’A再连接。

-pMD19-T应该是可以做蓝白斑筛选的吧，建议用LB AMP板加上IPTG+X-Gal做蓝白斑筛选，挑白斑做PCR。白斑的插入率应该有90%以上。

如果你现在已有LB AMP板，只需要加 100μl的100mM IPTG和
20μl的50mg/ml X-Gal在板上，涂抹均匀后37°C放置半个小时吸收IPTG和X-Gal，然后就可以用转化菌液涂板了。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-08-06 18:23:16
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馨-馨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 23:04:07
sunyu65045: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-08-07 15:19:12
第一，在做连接之前，电泳检验下你的PCR产物出现降解了没；
第二，你可以选择蓝白筛选；
第三，你的感受态活性高否；
第四，连接体系和连接时间是否有问题。
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3楼2014-08-06 21:57:58
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-08-06 18:23:16
-你确定在基因片段两端加上3‘A了么。如果没有，可以用Taq酶加3’A再连接。

-pMD19-T应该是可以做蓝白斑筛选的吧，建议用LB AMP板加上IPTG+X-Gal做蓝白斑筛选，挑白斑做PCR。白斑的插入率应该有90%以上。

如果 ...

PCR产物都加A了，我再试试蓝白斑筛选吧。想再问一下，X-mal溶解在什么溶液中比较好，这两种试剂都需要过滤除菌的吗？
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4楼2014-08-07 15:15:25
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 馨-馨 at 2014-08-06 21:57:58
第一，在做连接之前，电泳检验下你的PCR产物出现降解了没；
第二，你可以选择蓝白筛选；
第三，你的感受态活性高否；
第四，连接体系和连接时间是否有问题。

PCR产物是前一天纯化的电泳也鉴定了，贮存在-20 。感受态是直接从试剂公司购买的。连接体系是使用T4 连接酶 16摄氏度  10小时  将pMD19-T 与基因片段连接的。您帮我看看是哪出现问题了。我再试试蓝白斑筛选。  多谢了！
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5楼2014-08-07 15:18:42
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)
估计是非特异性带，建议你把这个较小的带，回收了，送测就知道了

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-08-07 19:57:46
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-07 19:57:46
估计是非特异性带，建议你把这个较小的带，回收了，送测就知道了

谢谢，我试一下。
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7楼2014-08-08 12:24:07
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馨-馨

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunyu65045 at 2014-08-07 15:18:42
PCR产物是前一天纯化的电泳也鉴定了，贮存在-20 。感受态是直接从试剂公司购买的。连接体系是使用T4 连接酶 16摄氏度  10小时  将pMD19-T 与基因片段连接的。您帮我看看是哪出现问题了。我再试试蓝白斑筛选。  多谢 ...

也有可能是你PCR产物的原因，你PCR的模板是什么？宏基因组，还是菌液啊。。
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8楼2014-08-09 14:59:59
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lyz65956

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunyu65045 at 2014-08-07 15:15:25
PCR产物都加A了，我再试试蓝白斑筛选吧。想再问一下，X-mal溶解在什么溶液中比较好，这两种试剂都需要过滤除菌的吗？...

xgal溶解于DMF中
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对自己更好点
9楼2014-08-10 12:16:28
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sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 馨-馨 at 2014-08-09 14:59:59
也有可能是你PCR产物的原因，你PCR的模板是什么？宏基因组，还是菌液啊。。...

模板是全基因组
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10楼2014-08-11 19:41:13
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