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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何检测目的片段转没转到质粒上？
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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何检测目的片段转没转到质粒上？ 已有10人参与

将目的基因片段连接到载体上，再导入到大肠杆菌中，LB培养基上长出了白斑，下一步我想挑一些单菌落做一下PCR，想看看目的片段转没转到质粒上，是将单菌落挑到加有氨苄的LB液体培养基里培养过夜，然后用这个菌液直接PCR么？还是提取质粒做PCR？如果这样该如何操作呢？有些茫然啊~
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1楼 2014-03-23 21:11:02
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-03-24 09:18:28
培养过夜后的菌液做模版直接PCR就行（可以取1微升做模版），引物、dNTP、buffer、程序什么的都跟普通PCR一样。
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2楼2014-03-24 08:18:39
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-03-24 09:18:36
直接菌液PCR就行，把菌沸水煮10分钟裂解下。也可以提质粒做双酶切看看有没有接上去。
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3楼2014-03-24 08:32:05
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-25 10:49:34
可以用2ML的管加650ul左右LB（含抗生素），小枪头挑单克隆摇菌。直接用菌液做PCR，不用煮沸。PCR预变性5min就可以了。     注意不要交叉污染和水污染了。
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4楼2014-03-24 16:43:07
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

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冰糖-葫芦娃(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:06:25
我感觉比较有说服力的是提取质粒进行PCR
即分3个泳道，1marker 2质粒 3酶切之后的质粒

这样子如果3泳道中两个条带分子大小加起来等于2泳道中分子大小，就证明你把目标基因成功连接到载体上了。
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5楼2014-03-24 17:15:55
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

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说错了，提取质粒跑电泳··，
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6楼2014-03-24 17:20:47
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yuanyuanlg01

铁虫 (初入文坛)

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:26
肯定是提取质粒然后放PCR呀。一般是你的质粒上是有抗性的，这样就能筛选出质粒成功进去的。然后挑单菌落，提取质粒放PCR，然后和之前的样品一起跑胶，你的插入片段，原质粒。然后大小一样的话，就能去测序进行最终的确认了。过程说的可能比较简略，大概情况就是这样。如有疑问欢迎一起讨论。
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7楼2014-03-24 19:37:50
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:35
我们一般都是菌落PCR以后挑亮的小摇后，提质粒做质粒PCR验证，同时再双酶切验证。

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天道酬勤
8楼2014-03-24 20:12:32
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:49
我们实验室一般是先菌落PCR，再摇菌步骤如下。
1.用牙签挑一下菌落在有抗性的LB固体板子上划上两三道线并在板子背面划线部位标注一下，37度培养。
2.牙签放在PCR溶液里稍微转动几下保证菌脱落到PCR体系中。
3.直接进行PCR，跑胶。确定阳性菌。
4.选取对应编号的划线菌，进行摇菌。
5.提取质粒，酶切，或测序验证。
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hehe
9楼2014-03-25 08:11:41
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amberqiong

新虫 (初入文坛)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-26 08:54:50
直接用菌液就行了，不过我一般都是用牙签挑菌的时候先在液体培养基中粘一下，再把牙签在PCR体系中粘一下，一点点菌就够做菌落PCR了
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10楼2014-03-25 16:23:56
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