应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何检测目的片段转没转到质粒上？
171/2返回列表12下一页
查看: 3304  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何检测目的片段转没转到质粒上？ 已有10人参与

将目的基因片段连接到载体上，再导入到大肠杆菌中，LB培养基上长出了白斑，下一步我想挑一些单菌落做一下PCR，想看看目的片段转没转到质粒上，是将单菌落挑到加有氨苄的LB液体培养基里培养过夜，然后用这个菌液直接PCR么？还是提取质粒做PCR？如果这样该如何操作呢？有些茫然啊~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-23 21:11:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-03-24 09:18:28
培养过夜后的菌液做模版直接PCR就行（可以取1微升做模版），引物、dNTP、buffer、程序什么的都跟普通PCR一样。
赞一下 回复此楼
2楼2014-03-24 08:18:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-03-24 09:18:36
直接菌液PCR就行，把菌沸水煮10分钟裂解下。也可以提质粒做双酶切看看有没有接上去。
赞一下 回复此楼
3楼2014-03-24 08:32:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-25 10:49:34
可以用2ML的管加650ul左右LB（含抗生素），小枪头挑单克隆摇菌。直接用菌液做PCR，不用煮沸。PCR预变性5min就可以了。     注意不要交叉污染和水污染了。
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-24 16:43:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冰糖-葫芦娃(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:06:25
我感觉比较有说服力的是提取质粒进行PCR
即分3个泳道，1marker 2质粒 3酶切之后的质粒

这样子如果3泳道中两个条带分子大小加起来等于2泳道中分子大小，就证明你把目标基因成功连接到载体上了。
赞一下 回复此楼
5楼2014-03-24 17:15:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

说错了，提取质粒跑电泳··，
赞一下 回复此楼
6楼2014-03-24 17:20:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanyuanlg01

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:26
肯定是提取质粒然后放PCR呀。一般是你的质粒上是有抗性的，这样就能筛选出质粒成功进去的。然后挑单菌落，提取质粒放PCR，然后和之前的样品一起跑胶，你的插入片段，原质粒。然后大小一样的话，就能去测序进行最终的确认了。过程说的可能比较简略，大概情况就是这样。如有疑问欢迎一起讨论。
赞一下 回复此楼
7楼2014-03-24 19:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:35
我们一般都是菌落PCR以后挑亮的小摇后，提质粒做质粒PCR验证，同时再双酶切验证。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
天道酬勤
8楼2014-03-24 20:12:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:49
我们实验室一般是先菌落PCR，再摇菌步骤如下。
1.用牙签挑一下菌落在有抗性的LB固体板子上划上两三道线并在板子背面划线部位标注一下，37度培养。
2.牙签放在PCR溶液里稍微转动几下保证菌脱落到PCR体系中。
3.直接进行PCR，跑胶。确定阳性菌。
4.选取对应编号的划线菌，进行摇菌。
5.提取质粒，酶切，或测序验证。
赞一下 回复此楼
hehe
9楼2014-03-25 08:11:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amberqiong

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-26 08:54:50
直接用菌液就行了，不过我一般都是用牙签挑菌的时候先在液体培养基中粘一下，再把牙签在PCR体系中粘一下，一点点菌就够做菌落PCR了
赞一下 回复此楼
10楼2014-03-25 16:23:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 冰糖-葫芦娃 的主题更新
171/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 澳大利亚 Murdoch University 全奖博士招生（3个名额）地质化工冶金领域 +61 AI8RaGaPaSCR 2026-08-07 64/3200 2026-08-14 05:45 by yNk0cTSDcreS
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +4 majunge000 2026-08-11 6/300 2026-08-13 16:50 by 四季常青藤
[基金申请] filecode +14 documentary 2026-08-10 16/800 2026-08-13 16:39 by 润生71
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 好奇怪的filecode +5 布布和一二 2026-08-08 6/300 2026-08-12 16:11 by 云上清扬
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭