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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何检测目的片段转没转到质粒上？
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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何检测目的片段转没转到质粒上？ 已有10人参与

将目的基因片段连接到载体上，再导入到大肠杆菌中，LB培养基上长出了白斑，下一步我想挑一些单菌落做一下PCR，想看看目的片段转没转到质粒上，是将单菌落挑到加有氨苄的LB液体培养基里培养过夜，然后用这个菌液直接PCR么？还是提取质粒做PCR？如果这样该如何操作呢？有些茫然啊~
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1楼 2014-03-23 21:11:02
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yuanyuanlg01

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:26
肯定是提取质粒然后放PCR呀。一般是你的质粒上是有抗性的，这样就能筛选出质粒成功进去的。然后挑单菌落，提取质粒放PCR，然后和之前的样品一起跑胶，你的插入片段，原质粒。然后大小一样的话，就能去测序进行最终的确认了。过程说的可能比较简略，大概情况就是这样。如有疑问欢迎一起讨论。
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7楼2014-03-24 19:37:50
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yuanyuanlg01

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 冰糖-葫芦娃 at 2014-03-25 21:47:59
我用的连接载体是promega的T载，应该是TA克隆吧？但是TA克隆需要在PCR产物末端加上A尾，那如何知道我的PCR产物末端有A？我用的是TaKara的普通Taq酶。...

哦，你用的是TA克隆，我们是酶切法的，不过你可以在PCR引物设计的时候加上呀。这个应该是没问题挺容易的把。希望有帮助。
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14楼2014-03-26 10:33:49
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