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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何检测目的片段转没转到质粒上? 已有10人参与

将目的基因片段连接到载体上,再导入到大肠杆菌中,LB培养基上长出了白斑,下一步我想挑一些单菌落做一下PCR,想看看目的片段转没转到质粒上,是将单菌落挑到加有氨苄的LB液体培养基里培养过夜,然后用这个菌液直接PCR么?还是提取质粒做PCR?如果这样该如何操作呢?有些茫然啊~
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 12:32:49
我们实验室一般是先菌落PCR,再摇菌步骤如下。
1.用牙签挑一下菌落在有抗性的LB固体板子上划上两三道线并在板子背面划线部位标注一下,37度培养。
2.牙签放在PCR溶液里稍微转动几下保证菌脱落到PCR体系中。
3.直接进行PCR,跑胶。确定阳性菌。
4.选取对应编号的划线菌,进行摇菌。
5.提取质粒,酶切,或测序验证。
hehe
9楼2014-03-25 08:11:41
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-03-24 09:18:28
培养过夜后的菌液做模版直接PCR就行(可以取1微升做模版),引物、dNTP、buffer、程序什么的都跟普通PCR一样。
2楼2014-03-24 08:18:39
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-03-24 09:18:36
直接菌液PCR就行,把菌沸水煮10分钟裂解下。也可以提质粒做双酶切看看有没有接上去。
3楼2014-03-24 08:32:05
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-25 10:49:34
可以用2ML的管加650ul左右LB(含抗生素),小枪头挑单克隆摇菌。直接用菌液做PCR,不用煮沸。PCR预变性5min就可以了。     注意不要交叉污染和水污染了。
4楼2014-03-24 16:43:07
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