应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » A-T克隆重组质粒筛选 菌落PCR
101/1返回列表
查看: 1520  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

sunyu65045

木虫 (初入文坛)

[求助] A-T克隆重组质粒筛选 菌落PCR 已有2人参与

我使用pMD19-T对1600bp基因片段进行A-T克隆，在含有Amp的LB平板上长有少量的菌落，分别挑取半个菌落进行菌落PCR，但是电泳确认是发现所有菌落的条带均一致但都小于目的片段（小于1000bp），PCR所用试剂均没有问题以前使用过，请高手指教是哪里出现了问题，万分感谢！！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-08-06 18:08:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 23:03:59
sunyu65045: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-07 15:13:13
-你确定在基因片段两端加上3‘A了么。如果没有，可以用Taq酶加3’A再连接。

-pMD19-T应该是可以做蓝白斑筛选的吧，建议用LB AMP板加上IPTG+X-Gal做蓝白斑筛选，挑白斑做PCR。白斑的插入率应该有90%以上。

如果你现在已有LB AMP板，只需要加 100μl的100mM IPTG和
20μl的50mg/ml X-Gal在板上，涂抹均匀后37°C放置半个小时吸收IPTG和X-Gal，然后就可以用转化菌液涂板了。
赞一下 回复此楼
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-08-06 18:23:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

馨-馨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 23:04:07
sunyu65045: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-08-07 15:19:12
第一，在做连接之前，电泳检验下你的PCR产物出现降解了没；
第二，你可以选择蓝白筛选；
第三，你的感受态活性高否；
第四，连接体系和连接时间是否有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2014-08-06 21:57:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-08-06 18:23:16
-你确定在基因片段两端加上3‘A了么。如果没有，可以用Taq酶加3’A再连接。

-pMD19-T应该是可以做蓝白斑筛选的吧，建议用LB AMP板加上IPTG+X-Gal做蓝白斑筛选，挑白斑做PCR。白斑的插入率应该有90%以上。

如果 ...

PCR产物都加A了，我再试试蓝白斑筛选吧。想再问一下，X-mal溶解在什么溶液中比较好，这两种试剂都需要过滤除菌的吗？
赞一下 回复此楼
4楼2014-08-07 15:15:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 馨-馨 at 2014-08-06 21:57:58
第一，在做连接之前，电泳检验下你的PCR产物出现降解了没；
第二，你可以选择蓝白筛选；
第三，你的感受态活性高否；
第四，连接体系和连接时间是否有问题。

PCR产物是前一天纯化的电泳也鉴定了，贮存在-20 。感受态是直接从试剂公司购买的。连接体系是使用T4 连接酶 16摄氏度  10小时  将pMD19-T 与基因片段连接的。您帮我看看是哪出现问题了。我再试试蓝白斑筛选。  多谢了！
赞一下 回复此楼
5楼2014-08-07 15:18:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)
估计是非特异性带，建议你把这个较小的带，回收了，送测就知道了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-08-07 19:57:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-07 19:57:46
估计是非特异性带，建议你把这个较小的带，回收了，送测就知道了

谢谢，我试一下。
回复此楼
7楼2014-08-08 12:24:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

馨-馨

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunyu65045 at 2014-08-07 15:18:42
PCR产物是前一天纯化的电泳也鉴定了，贮存在-20 。感受态是直接从试剂公司购买的。连接体系是使用T4 连接酶 16摄氏度  10小时  将pMD19-T 与基因片段连接的。您帮我看看是哪出现问题了。我再试试蓝白斑筛选。  多谢 ...

也有可能是你PCR产物的原因，你PCR的模板是什么？宏基因组，还是菌液啊。。
赞一下 回复此楼
8楼2014-08-09 14:59:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lyz65956

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunyu65045 at 2014-08-07 15:15:25
PCR产物都加A了，我再试试蓝白斑筛选吧。想再问一下，X-mal溶解在什么溶液中比较好，这两种试剂都需要过滤除菌的吗？...

xgal溶解于DMF中
赞一下 回复此楼
对自己更好点
9楼2014-08-10 12:16:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunyu65045

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 馨-馨 at 2014-08-09 14:59:59
也有可能是你PCR产物的原因，你PCR的模板是什么？宏基因组，还是菌液啊。。...

模板是全基因组
回复此楼
10楼2014-08-11 19:41:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sunyu65045 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 311求调剂 +7 26研0 2026-03-15 7/350 2026-03-21 19:06 by ColorlessPI
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +20 不知道叫什么！ 2026-03-15 22/1100 2026-03-21 19:03 by ColorlessPI
[考研] 313求调剂 +4 肆叁贰壹22 2026-03-19 4/200 2026-03-21 17:33 by ColorlessPI
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 机械专硕299求调剂至材料 +3 kkcoco25 2026-03-16 4/200 2026-03-21 03:52 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 Ma_xt 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:05 by JourneyLucky
[考研] 华东师范大学-071000生物学-293分-求调剂 +3 研究生何瑶明 2026-03-18 3/150 2026-03-21 01:30 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +5 冬十三 2026-03-18 5/250 2026-03-21 00:16 by JourneyLucky
[考研] 350求调剂 +5 weudhdk 2026-03-19 5/250 2026-03-20 22:04 by luoyongfeng
[考研] 求调剂一志愿南京航空航天大学289分 +3 @taotao 2026-03-19 3/150 2026-03-20 21:34 by JourneyLucky
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
[考研] 353求调剂 +3 拉钩不许变 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:56 by JourneyLucky
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-19 5/250 2026-03-19 23:51 by 23Postgrad
[考研] 081700化工学硕调剂 +3 【1】 2026-03-16 3/150 2026-03-19 23:40 by edmund7
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 334求调剂 +3 志存高远意在机� 2026-03-16 3/150 2026-03-18 08:34 by lm4875102
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
[考研] 283求调剂 +3 听风就是雨； 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:41 by 热情沙漠
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭