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A-T克隆重组质粒筛选 菌落PCR 已有2人参与
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| 我使用pMD19-T对1600bp基因片段进行A-T克隆，在含有Amp的LB平板上长有少量的菌落，分别挑取半个菌落进行菌落PCR，但是电泳确认是发现所有菌落的条带均一致但都小于目的片段（小于1000bp），PCR所用试剂均没有问题以前使用过，请高手指教是哪里出现了问题，万分感谢！！！！！ |
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5楼2014-08-07 15:18:42
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 23:03:59
sunyu65045: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-07 15:13:13
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-你确定在基因片段两端加上3‘A了么。如果没有，可以用Taq酶加3’A再连接。 -pMD19-T应该是可以做蓝白斑筛选的吧，建议用LB AMP板加上IPTG+X-Gal做蓝白斑筛选，挑白斑做PCR。白斑的插入率应该有90%以上。 如果你现在已有LB AMP板，只需要加 100μl的100mM IPTG和 20μl的50mg/ml X-Gal在板上，涂抹均匀后37°C放置半个小时吸收IPTG和X-Gal，然后就可以用转化菌液涂板了。 |
2楼2014-08-06 18:23:16
馨-馨
银虫 (小有名气)
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- 散金: 34
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- 虫号: 1390789
- 注册: 2011-09-05
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2014-08-06 21:57:58
4楼2014-08-07 15:15:25
50