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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带问题
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asako2010

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR条带问题 已有12人参与

请问各位大神第一张图是什么情况？我是PCR完了跑胶的。为什么只有拖带没有目的条带呢？第二张图条带很淡要怎么样条带才能亮啊？

PCR条带问题
IMG_9737.JPG


PCR条带问题-1
IMG_9728.JPG
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asako2010

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1楼 2014-07-20 18:41:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
asako2010(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:41:54
两张图里很明显的引物二聚，说明引物几乎没有结合模板。按照你所说的之前能扩增出来，现在扩不出来，那么你的PCR的温度应该是没有问题的。有可能出问题的方面有：
1. 污染。包括引物，水，Buffer和酶等等。确定你跟以前用的是同样的东西。你可以借一些别人的引物，用这些试剂试着扩增些别的东西，如果能够扩增成功，说明你的试剂是没有问题的。那么问题有可能是在引物或者模板上。
2. 模板质量问题。不知道你这次用的模板和以前是不是一样的，还是新制备的。很有可能是你在制备新的模板的时候DNA提纯过程出了问题。比如DNA沉淀用的乙醇没有滤干净。离子也会影响PCR的扩增。
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asako2010
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
11楼2014-07-22 02:48:14
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普通回帖

xzy0425

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 20:40:21
你上边的两个图均属于PCR条件没有摸清楚造成的目的基因没扩出来或扩的不多不理想。PCR的目的是扩增目的基因，以获得大量的目的产物进行下一步操作。为了高效获得目的产物，我们必须确定最佳的PCR条件，构建最合适的PCR体系。PCR体系包括：模板、引物、底物、酶、缓冲液、双蒸水。根据引物序列，推测出退火的最适温度，确定PCR反应参数，然后确定PCR体系应加的各成分的最适量。摸索PCR体系及参数时，我们使用的是小体系，如20μl。待条件确定后，再进行体系扩大，最好是体系不变，管数增加，这样有利于获得理想的结果，因为有时候单纯等体积扩大体系难以获得理想结果。
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asako2010
2楼2014-07-20 18:59:03
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 20:40:29
降低退火温度试一下，你的引物二聚体很亮，也有可能是两个引物的序列容易形成二聚体。个人建议，先降低退火温度，最低退火温度可以使48度，如果还是无法使目的条带变亮，那么重新设计引物。
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asako2010
3楼2014-07-20 19:34:54
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asako2010

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-07-20 18:59:03
你上边的两个图均属于PCR条件没有摸清楚造成的目的基因没扩出来或扩的不多不理想。PCR的目的是扩增目的基因，以获得大量的目的产物进行下一步操作。为了高效获得目的产物，我们必须确定最佳的PCR条件，构建最合适的 ...

谢谢啊

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4楼2014-07-21 13:34:40
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asako2010

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-07-20 19:34:54
降低退火温度试一下，你的引物二聚体很亮，也有可能是两个引物的序列容易形成二聚体。个人建议，先降低退火温度，最低退火温度可以使48度，如果还是无法使目的条带变亮，那么重新设计引物。

非常感谢，试试48

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5楼2014-07-21 13:35:10
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:50:36
1、你的“产物”主要是引物二聚体。
2、原因是多方面的，你需要回头看一下你的引物序列（主要是GC比例）、甚至扩增产物的GC比例、理论Tm值等等。
3、改善措施：
（1）尝试提高annealing温度（不是降低！），最好做个gradient PCR,以找出最合适的annealing温度；
（2）如果gradient PCR都无法找到满意的annealing温度，则考虑在反应中加入DMSO，具体条件仍需要摸索。
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6楼2014-07-21 13:57:33
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asako2010

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
可是几天前还能扩出来现在就不行了，是不是引物被污染了

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7楼2014-07-22 00:47:08
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-21 13:57:33
1、你的“产物”主要是引物二聚体。
2、原因是多方面的，你需要回头看一下你的引物序列（主要是GC比例）、甚至扩增产物的GC比例、理论Tm值等等。
3、改善措施：
（1）尝试提高annealing温度（不是降低！），最好 ...

可是几天前还能扩出来现在就不行了，是不是引物被污染了

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8楼2014-07-22 00:48:08
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by asako2010 at 2014-07-21 13:35:10
非常感谢，试试48
...

可是几天前还能扩出来现在就不行了，是不是引物被污染了

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9楼2014-07-22 00:48:27
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by asako2010 at 2014-07-21 13:34:40
谢谢啊
...

可是几天前还能扩出来现在就不行了，是不是引物被污染了

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10楼2014-07-22 00:48:50
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