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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带问题
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
asako2010(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:41:54
两张图里很明显的引物二聚，说明引物几乎没有结合模板。按照你所说的之前能扩增出来，现在扩不出来，那么你的PCR的温度应该是没有问题的。有可能出问题的方面有：
1. 污染。包括引物，水，Buffer和酶等等。确定你跟以前用的是同样的东西。你可以借一些别人的引物，用这些试剂试着扩增些别的东西，如果能够扩增成功，说明你的试剂是没有问题的。那么问题有可能是在引物或者模板上。
2. 模板质量问题。不知道你这次用的模板和以前是不是一样的，还是新制备的。很有可能是你在制备新的模板的时候DNA提纯过程出了问题。比如DNA沉淀用的乙醇没有滤干净。离子也会影响PCR的扩增。
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asako2010
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
11楼2014-07-22 02:48:14
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duanepp

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
asako2010(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:42:04
不行就去做个梯度pcr看下，如果还不行的话就换引物吧
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12楼2014-07-22 08:29:22
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by duanepp at 2014-07-22 08:29:22
不行就去做个梯度pcr看下，如果还不行的话就换引物吧

之前做过都做出来的，现在不行了，郁闷

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2014-07-22 08:56:51
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lichao4214

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
asako2010(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:42:43
之前做出来，现在不行了，说明条件你都摸索了的，那应该是污染了吧
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14楼2014-07-22 10:01:20
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mengyiwudi

铁虫 (初入文坛)
这是没跑出来吧，估计是引物降解或者dna浓度不够了。调整下反应体系再试下
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未来在平凡，谁给我答案
15楼2014-07-22 15:21:35
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by mengyiwudi at 2014-07-22 15:21:35
这是没跑出来吧，估计是引物降解或者dna浓度不够了。调整下反应体系再试下

出现的二聚体很亮啊，我刚刚dna跑胶了还是有东西的，那是什么问题啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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16楼2014-07-22 19:30:34
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mengyiwudi

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by asako2010 at 2014-07-22 19:30:34
出现的二聚体很亮啊，我刚刚dna跑胶了还是有东西的，那是什么问题啊
...

二聚体很亮说明你的这对引物自我连接合成了，你可以考虑重新设计引物试试看
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未来在平凡，谁给我答案
17楼2014-07-24 10:36:22
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引物二聚体很明显，首先检查一下引物的序列，觉得没有大的问题，就自己设计一个退火温度梯度PCR。
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18楼2014-07-24 11:16:00
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

把引物、模板重新用 TE buffer 稀释一下，用你前几天扩出来的条件PCR
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追梦是一个快乐的过程。
19楼2014-07-24 22:19:27
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 圆yy at 2014-07-24 11:16:00
引物二聚体很明显，首先检查一下引物的序列，觉得没有大的问题，就自己设计一个退火温度梯度PCR。

谢谢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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20楼2014-07-25 08:17:02
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