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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带问题
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by panhp2004 at 2014-07-24 22:19:27
把引物、模板重新用 TE buffer 稀释一下，用你前几天扩出来的条件PCR

谢谢

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21楼2014-07-25 08:17:11
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980979990

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
asako2010(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:02:59
你是高保真扩的还是用的Taq酶扩增的，什么样的体系？
你的的引物二聚体很亮，你可以在扩增体系中加一点DMSO来降低引物二聚体，如果不行的话估计是要换引物了
加油！！！
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22楼2014-07-25 09:21:40
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朱七五

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:03:09
可以看出：1、你的引物设计的不好，引物二聚体太强、、、
           2、同样，PCR条件没有摸清楚，建议做个梯度PCR，或者touch down PCR会好些、、
          3、一般情况下，退火温度降低，PCR产率会升高，目的条带会亮，但同时会出现杂带的出现，像你这情况第二张可以降低温度4-6度试试
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做最好的自己！notinvaineveryday
23楼2014-07-25 11:59:01
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jianwuzhan

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-26 17:03:19
第一张图看起来是条带降解了，个人觉得可能和你们配置的电泳液有关，或者是PCR产物过少，在照紫外的时候时间过长，可以改善一下PCR的条件，或是看看引物是否有不合理之处。
第二张图的话，首先你要确认你的引物是否可以在优化，其次，提取模板后测个浓度，使模板浓度高一些，跑完PCR之后，上样量加大一些，建议你可以尝试一下。
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asako2010
24楼2014-07-25 13:07:19
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asako2010

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 02:48:14
两张图里很明显的引物二聚，说明引物几乎没有结合模板。按照你所说的之前能扩增出来，现在扩不出来，那么你的PCR的温度应该是没有问题的。有可能出问题的方面有：
1. 污染。包括引物，水，Buffer和酶等等。确定你跟 ...

谢谢

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25楼2014-07-25 13:57:49
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asako2010

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
24楼: Originally posted by jianwuzhan at 2014-07-25 13:07:19
第一张图看起来是条带降解了，个人觉得可能和你们配置的电泳液有关，或者是PCR产物过少，在照紫外的时候时间过长，可以改善一下PCR的条件，或是看看引物是否有不合理之处。
第二张图的话，首先你要确认你的引物是否 ...

谢谢

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26楼2014-07-25 14:01:09
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prominetsun

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by asako2010 at 2014-07-22 00:47:08
可是几天前还能扩出来现在就不行了，是不是引物被污染了

我也出现了则个问题，之前PCR都好好的，然后中间休息了十天，做了三组PCR死活P不出来了！！！只有marker有条带，其他什么都没有。。。我也在想是不是引物被污染了。。。但是一直换枪头的啊，没记得污染过。。。还是降解了。。。哭。。。不知你现在这个问题解决了吗？
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27楼2014-07-26 15:54:27
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by prominetsun at 2014-07-26 15:54:27
我也出现了则个问题，之前PCR都好好的，然后中间休息了十天，做了三组PCR死活P不出来了！！！只有marker有条带，其他什么都没有。。。我也在想是不是引物被污染了。。。但是一直换枪头的啊，没记得污染过。。。还是 ...

没有啊，不知道怎么弄，你怎么知道是引物降解了啊

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28楼2014-07-27 08:02:27
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asako2010

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by prominetsun at 2014-07-26 15:54:27
我也出现了则个问题，之前PCR都好好的，然后中间休息了十天，做了三组PCR死活P不出来了！！！只有marker有条带，其他什么都没有。。。我也在想是不是引物被污染了。。。但是一直换枪头的啊，没记得污染过。。。还是 ...

而且我的二聚体很亮啊，引物应该没降解吧

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29楼2014-07-27 08:03:24
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forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

没有特异性扩增，建议换引物。
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30楼2014-07-27 20:16:00
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