| 查看: 3421 | 回复: 14 | |||
biology-girl新虫 (正式写手)
|
[求助]
RNA 反转录后依然有内含子序列？ 已有3人参与
|
||
| 如题，最近克隆一个基因，但是有内含子，遂提取RNA 后反转录，可是测序结果回来后发现还是有内含子序列。请问各位大侠 设施怎么回事？ 是我的方法操作有问题？还是NCBI 上公布的有问题（此基因以前没人克隆过） PS：没人克隆过那个基因，那NCBI 上的CDS 区 是怎么得来的？ 是不是NCBI上的不对呀？ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有254人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- RNA 反转录后 还有内含子？
已经有14人回复
- 反转录RNA时出现基因组DNA的原因有哪些？
已经有10人回复
- RNA含量低，反转录成功，可以用于PCR验证？？
已经有7人回复
- 测序结果与NCBI有差别，求解释！
已经有7人回复
- 已知一个基因的DNA序列，怎么得到它的cDNA序列，我想做RT-PCR
已经有6人回复
- 大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了
已经有44人回复
- 反转录后扩增有好几条带
已经有8人回复
- RNA提取与反转录
已经有9人回复
- 反转录后用cDNA做模板扩不出目的基因怎么办？？？
已经有6人回复
- 基因序列比对 内含子比对
已经有8人回复
- 对于一个没有内含子的基因，请问用基因组或cDNA作为模板跑PCR对于结果有什么影响吗？
已经有11人回复
- 如何处理大量的fasta格式的rna序列
已经有16人回复
- 关于RNA反转录
已经有13人回复
- 提取RNA后，反转录后用β-actinpcr很多条带
已经有20人回复
- rna终于提取出来了，可是反转录pcr（rt pcr）没有条带
已经有19人回复
- 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已经有18人回复
- RNA浓度只有几十ng/ul，不知道可不可以反转录做RT（在线急等）
已经有12人回复
- 【求助/交流】总RNA反转录出的cDNA 怎样检测出来
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于引物设计的问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】反转录时该选用oligo dT还是 随机6引物？
已经有9人回复
- 【求助/交流】是否所有的基因都有内含子？
已经有11人回复
- 【求助/交流】RNA反转录合成cDNA电泳图
已经有14人回复
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+6, 鼓励交流！ 2014-07-19 16:49:17
gyesang: 回帖置顶 2014-07-27 20:59:55
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+6, 鼓励交流！ 2014-07-19 16:49:17
gyesang: 回帖置顶 2014-07-27 20:59:55
|
1.你的基因上应该不止一个内含子吧。你提出来的RNA是只保留了其中的几个内含子还是所有的内含子全部存在？如果内含子全部存在我就有理由怀疑你的RNA中是否有基因组的污染。你首先需要排除这个可能 2.如果只是一部分内含子存在那你得排除没有正常剪切这种情况。你说的挑了十几个重组菌提了质粒后测序是在一个平板上长的转化子吗？你的平板上长了有多少个转化子？你这种情况挑十几个还是太少了。要有说服力至少得挑50个—100个吧。然后算一个你这种带内含子的比例，另外你还得再提一次RNA重复1—2次试验。一般不充分的剪切和你的培养条件还是有关系的，如果可以的话试着换一下培养条件试试。 3.如果把不正常剪切这种情况排除，证明你的实验结果是合理的。那你下一步还需要尝试质疑NCBI上已提交序列的合理性，首先就是功能对比验证，用融合PCR除去那个内含子得到和NCBI上一致的基因作为你的这个带内含子基因的对照，之后一起表达蛋白进行功能验证，如果你的基因有功能而网上的基因没功能，那你就有推翻NCBI上那个序列的证据了。如果两个蛋白都有功能但是有差异的话，这就是个更有意思的结论了，从这个结果又可以延伸出一个课题。如果你不做功能的话，可以用个定量PCR从转录水平去验证。你想推翻现在已有的结果就必须拿出有力的证据。 4.你的这个结果只要证据充分而且你研究的这个基因的意义明显一篇高分SCI是跑不了的，如果只是提个RNA，测个序列算个比例的话，sci很困难。 |
6楼2014-07-19 13:12:55
2楼2014-07-19 09:21:52
yuehedou
木虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 2171.4
- 红花: 2
- 帖子: 215
- 在线: 190.5小时
- 虫号: 1996646
- 注册: 2012-09-12
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
3楼2014-07-19 10:43:11
biology-girl
新虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 888.7
- 散金: 23
- 红花: 3
- 帖子: 961
- 在线: 131.6小时
- 虫号: 2403242
- 注册: 2013-04-06
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2014-07-19 10:56:34
biology-girl
新虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 888.7
- 散金: 23
- 红花: 3
- 帖子: 961
- 在线: 131.6小时
- 虫号: 2403242
- 注册: 2013-04-06
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2014-07-19 10:57:57
biology-girl
新虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 888.7
- 散金: 23
- 红花: 3
- 帖子: 961
- 在线: 131.6小时
- 虫号: 2403242
- 注册: 2013-04-06
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2014-07-20 13:56:56
biology-girl
新虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 888.7
- 散金: 23
- 红花: 3
- 帖子: 961
- 在线: 131.6小时
- 虫号: 2403242
- 注册: 2013-04-06
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
8楼2014-07-20 13:57:02
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:24:39
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:24:39
|
1.有没有污染先看你的测序结果，你的基因有几个内含子？而你的测序结果又保留了几个内含子？如果你的基因里包含了NCBI上所预测的所有内含子那基因组污染的可能性非常大。如果只包含一个或一部分内含子，那基因组污染的可能性就已经排除了。琼脂糖胶是有个分辨率的，你肉眼看不到并不代表就没有。 2.你RT-PCR做完是连T载体吗？怎么快100个转化子里才这么点阳性，你用的是什么taq酶，连接体系是多少？基因与载体摩尔比又是多少？尽管你是分几次做的。但是你的阳性太少就没法排除偶然的错误剪切导致的mRNA前体的可能性。 |
9楼2014-07-20 14:26:53
biology-girl
新虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 888.7
- 散金: 23
- 红花: 3
- 帖子: 961
- 在线: 131.6小时
- 虫号: 2403242
- 注册: 2013-04-06
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
10楼2014-07-21 09:21:07
5