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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » RNA 反转录后依然有内含子序列？
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biology-girl

新虫 (正式写手)

[求助] RNA 反转录后依然有内含子序列？ 已有3人参与

如题，最近克隆一个基因，但是有内含子，遂提取RNA 后反转录，可是测序结果回来后发现还是有内含子序列。请问各位大侠 设施怎么回事？ 是我的方法操作有问题？还是NCBI 上公布的有问题（此基因以前没人克隆过） PS：没人克隆过那个基因，那NCBI 上的CDS 区 是怎么得来的？ 是不是NCBI上的不对呀？
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1楼 2014-07-19 08:43:40
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+6, 鼓励交流！ 2014-07-19 16:49:17
gyesang: 回帖置顶 2014-07-27 20:59:55
1.你的基因上应该不止一个内含子吧。你提出来的RNA是只保留了其中的几个内含子还是所有的内含子全部存在？如果内含子全部存在我就有理由怀疑你的RNA中是否有基因组的污染。你首先需要排除这个可能
2.如果只是一部分内含子存在那你得排除没有正常剪切这种情况。你说的挑了十几个重组菌提了质粒后测序是在一个平板上长的转化子吗？你的平板上长了有多少个转化子？你这种情况挑十几个还是太少了。要有说服力至少得挑50个—100个吧。然后算一个你这种带内含子的比例，另外你还得再提一次RNA重复1—2次试验。一般不充分的剪切和你的培养条件还是有关系的，如果可以的话试着换一下培养条件试试。
3.如果把不正常剪切这种情况排除，证明你的实验结果是合理的。那你下一步还需要尝试质疑NCBI上已提交序列的合理性，首先就是功能对比验证，用融合PCR除去那个内含子得到和NCBI上一致的基因作为你的这个带内含子基因的对照，之后一起表达蛋白进行功能验证，如果你的基因有功能而网上的基因没功能，那你就有推翻NCBI上那个序列的证据了。如果两个蛋白都有功能但是有差异的话，这就是个更有意思的结论了，从这个结果又可以延伸出一个课题。如果你不做功能的话，可以用个定量PCR从转录水平去验证。你想推翻现在已有的结果就必须拿出有力的证据。
4.你的这个结果只要证据充分而且你研究的这个基因的意义明显一篇高分SCI是跑不了的，如果只是提个RNA，测个序列算个比例的话，sci很困难。
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6楼2014-07-19 13:12:55
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:24:39
引用回帖:
7楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-20 13:56:56
谢谢，我的RNA 在电泳图上看 效果较好 只有三条带，表面上看不存在总DNA污染的可能，不过我没有用Dnase 处理，不知道会不会有影响。
十几个转化子是分多次做的，不是一个板，一般我需要调96个菌（PCR仪有96个孔） ...

1.有没有污染先看你的测序结果，你的基因有几个内含子？而你的测序结果又保留了几个内含子？如果你的基因里包含了NCBI上所预测的所有内含子那基因组污染的可能性非常大。如果只包含一个或一部分内含子，那基因组污染的可能性就已经排除了。琼脂糖胶是有个分辨率的，你肉眼看不到并不代表就没有。
2.你RT-PCR做完是连T载体吗？怎么快100个转化子里才这么点阳性，你用的是什么taq酶，连接体系是多少？基因与载体摩尔比又是多少？尽管你是分几次做的。但是你的阳性太少就没法排除偶然的错误剪切导致的mRNA前体的可能性。
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9楼2014-07-20 14:26:53
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-21 09:21:07
我用的是高保真酶，我们实验室除了菌落PCR 没人用taq酶。很正常我的基因有4KB那么大，假阳性率当然高。...

ExTaq?确定是末端加A酶，我实验室也有连4K的基因，阳性率很高的。
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11楼2014-07-21 09:27:08
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 21:00:18
引用回帖:
14楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-22 11:19:43
EX taq 突变率太高了吧，这种预混酶我们只是为了菌落PCR 方便 才用的，以前有师姐答辩的时候就被问到，尤其是后续要做突变和敲除，这种酶毫无说服力。连4K的阳性率很高？ 可能你们实验室比较厉害吧，至少我是第一次 ...

1.很多高保真酶3'5'外切活性很高的，扩出来平末端占绝大多数。你的高保真酶是哪个牌子的，确定有加A功能吗，我实验室都是用的LA taq加A效果很不错，保真性也可以，EXtaq其实也可以只要PCR的总反应时间控制住保真性还是可以的。
2.虽然没有连4K以上的，但是3.5K左右的也是经常做啊，连T载体效率很高的。你酶连的具体步骤如何，基因和载体都加了多少摩尔？
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15楼2014-07-22 15:06:18
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