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biology-girl

新虫 (正式写手)

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[求助] RNA 反转录后依然有内含子序列？已有3人参与

如题，最近克隆一个基因，但是有内含子，遂提取RNA 后反转录，可是测序结果回来后发现还是有内含子序列。请问各位大侠设施怎么回事？是我的方法操作有问题？还是NCBI 上公布的有问题（此基因以前没人克隆过） PS：没人克隆过那个基因，那NCBI 上的CDS 区是怎么得来的？是不是NCBI上的不对呀？

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1楼 2014-07-19 08:43:40

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:24:39

引用回帖:

7楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-20 13:56:56
谢谢，我的RNA 在电泳图上看效果较好只有三条带，表面上看不存在总DNA污染的可能，不过我没有用Dnase 处理，不知道会不会有影响。
十几个转化子是分多次做的，不是一个板，一般我需要调96个菌（PCR仪有96个孔） ...

1.有没有污染先看你的测序结果，你的基因有几个内含子？而你的测序结果又保留了几个内含子？如果你的基因里包含了NCBI上所预测的所有内含子那基因组污染的可能性非常大。如果只包含一个或一部分内含子，那基因组污染的可能性就已经排除了。琼脂糖胶是有个分辨率的，你肉眼看不到并不代表就没有。
2.你RT-PCR做完是连T载体吗？怎么快100个转化子里才这么点阳性，你用的是什么taq酶，连接体系是多少？基因与载体摩尔比又是多少？尽管你是分几次做的。但是你的阳性太少就没法排除偶然的错误剪切导致的mRNA前体的可能性。