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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » RNA 反转录后依然有内含子序列？
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biology-girl

新虫 (正式写手)

[求助] RNA 反转录后依然有内含子序列？ 已有3人参与

如题，最近克隆一个基因，但是有内含子，遂提取RNA 后反转录，可是测序结果回来后发现还是有内含子序列。请问各位大侠 设施怎么回事？ 是我的方法操作有问题？还是NCBI 上公布的有问题（此基因以前没人克隆过） PS：没人克隆过那个基因，那NCBI 上的CDS 区 是怎么得来的？ 是不是NCBI上的不对呀？
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1楼 2014-07-19 08:43:40
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:24:39
引用回帖:
7楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-20 13:56:56
谢谢，我的RNA 在电泳图上看 效果较好 只有三条带，表面上看不存在总DNA污染的可能，不过我没有用Dnase 处理，不知道会不会有影响。
十几个转化子是分多次做的，不是一个板，一般我需要调96个菌（PCR仪有96个孔） ...

1.有没有污染先看你的测序结果，你的基因有几个内含子？而你的测序结果又保留了几个内含子？如果你的基因里包含了NCBI上所预测的所有内含子那基因组污染的可能性非常大。如果只包含一个或一部分内含子，那基因组污染的可能性就已经排除了。琼脂糖胶是有个分辨率的，你肉眼看不到并不代表就没有。
2.你RT-PCR做完是连T载体吗？怎么快100个转化子里才这么点阳性，你用的是什么taq酶，连接体系是多少？基因与载体摩尔比又是多少？尽管你是分几次做的。但是你的阳性太少就没法排除偶然的错误剪切导致的mRNA前体的可能性。
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大家相互帮助哈
9楼2014-07-20 14:26:53
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-07-19 16:48:49
我觉得你是对的   NCBI上的上传序列一般开始是用计算机预测的！恭喜你，发现了新的至少是mRNA
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
2楼2014-07-19 09:21:52
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yuehedou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-07-19 16:48:57
可变剪接？或者你提出来的不是成熟mRNA而是它的前体？当然如楼上所说更好了。
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每天都为自己的无知而羞耻！
3楼2014-07-19 10:43:11
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biology-girl

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuehedou at 2014-07-19 10:43:11
可变剪接？或者你提出来的不是成熟mRNA而是它的前体？当然如楼上所说更好了。

可是我已经重复了很多遍，重组菌找了十几个都是这种情况，这是不是可以排除可变剪切？
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4楼2014-07-19 10:56:34
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