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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于RNA反转录
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于RNA反转录

我们实验反转录的试剂盒是Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司  里面只有5xM-MLV Buffer和RTase M-MLV(RNase H-)这两种试剂，其他的Oligo(dT)和dNTP Mixture都没有，我们之前有个别的试剂盒，里面有这两样，但是后面的（μM)不一样，这样反转录的还可以吗？？？比如，要求的Oligo(dT)12-18 Primer (50μM),而我有的只是10μM，前者加一微升，后者加5微升，就一样了吗？？？还是怎么样子？最后真的有必要检测cDNA吗，好茫然啊~（提取的是两栖类的RNA，质量还可以，有明显的两条带）
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1楼 2012-05-23 11:06:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-23 20:51:38
检测cDNA，可以用Q3000测下浓度与吸光度值嘛。反转录的时候注意灭火一下就可以了，楼上已经回答的很详细了，个人感觉不必拘泥于试剂盒说明书剂量，体系的选择有可能要在试剂盒的基础上做改变的
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4楼2012-05-23 17:28:48
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普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助，今天很有空哦 2012-05-23 14:08:51
嗯.....................
       当然可以啊 10uM多加4倍体积就成了50uM啦
       没有必要检测cDNA 因为普通方法你也没法检测 如果不放心参照某些文献设计引物做3‘/5’完整度实验这是通用的检测cDNA方法
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-05-23 12:53:39
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 12:53:39:
嗯.....................
       当然可以啊 10uM多加4倍体积就成了50uM啦
       没有必要检测cDNA 因为普通方法你也没法检测 如果不放心参照某些文献设计引物做3‘/5’完整度实验这是通用的检测cDNA方法

可是那样的话，整个体积就又变了啊，完全和试剂盒里要求的体积不一样了，那样会有影响吗？？？
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3楼2012-05-23 14:59:56
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-23 17:28:48
检测cDNA，可以用Q3000测下浓度与吸光度值嘛。反转录的时候注意灭火一下就可以了，楼上已经回答的很详细了，个人感觉不必拘泥于试剂盒说明书剂量，体系的选择有可能要在试剂盒的基础上做改变的

我测不了浓度和吸光值，不过谢谢了~
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5楼2012-05-25 21:56:00
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2 2012-05-30 13:45:14
如果是用来克隆基因，那就不必检测了。如果是打算做定量，那就用cDNA来扩增下actin等内参基因，内参基因能扩增出来，那一般就ok啦。
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6楼2012-05-25 22:13:19
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-25 22:13:19
如果是用来克隆基因，那就不必检测了。如果是打算做定量，那就用cDNA来扩增下actin等内参基因，内参基因能扩增出来，那一般就ok啦。

恩，是用来做克隆，不过就是担心，如果没有条带的话，还是要检测cDNA是不是能用的，而且因为我做的物种不会去做荧光定量，所以没有设计RT引物，也没有ACTIN引物可以用。麻烦就麻烦在我现在是两个试剂盒混着用的，所以就心里没底。
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7楼2012-05-27 10:23:37
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zqx128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦-妖精 at 2012-05-23 14:59:56
可是那样的话，整个体积就又变了啊，完全和试剂盒里要求的体积不一样了，那样会有影响吗？？？...

可以通过水的用量来调整体系的总量不变，如果还是调不过来，总量有点差别也不会影响太大。
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8楼2012-05-27 15:10:24
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zqx128 at 2012-05-27 15:10:24
可以通过水的用量来调整体系的总量不变，如果还是调不过来，总量有点差别也不会影响太大。...

就是加水的问题，如果调节试剂的用量的话，我怕一点水都加不了了，那样也可以吗？
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9楼2012-05-29 09:55:56
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longrna

新虫 (正式写手)
★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-30 13:45:27
有关随机引物加的量问题，不同的公司加的量都不一样。
可能有的公司50uM的加1ul，也有100uM的加1ul，也有20pM/ul加1ul的，关键看你参考哪个公司的。
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伟大航线....
10楼2012-05-29 10:50:25
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