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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于RNA反转录

我们实验反转录的试剂盒是Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司  里面只有5xM-MLV Buffer和RTase M-MLV(RNase H-)这两种试剂,其他的Oligo(dT)和dNTP Mixture都没有,我们之前有个别的试剂盒,里面有这两样,但是后面的(μM)不一样,这样反转录的还可以吗???比如,要求的Oligo(dT)12-18 Primer (50μM),而我有的只是10μM,前者加一微升,后者加5微升,就一样了吗???还是怎么样子?最后真的有必要检测cDNA吗,好茫然啊~(提取的是两栖类的RNA,质量还可以,有明显的两条带)
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2 2012-05-30 13:45:14
如果是用来克隆基因,那就不必检测了。如果是打算做定量,那就用cDNA来扩增下actin等内参基因,内参基因能扩增出来,那一般就ok啦。
6楼2012-05-25 22:13:19
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助,今天很有空哦 2012-05-23 14:08:51
嗯.....................
       当然可以啊 10uM多加4倍体积就成了50uM啦
       没有必要检测cDNA 因为普通方法你也没法检测 如果不放心参照某些文献设计引物做3‘/5’完整度实验这是通用的检测cDNA方法
       个人看法 若有说错请高手指点
Let God do with it as He wills
2楼2012-05-23 12:53:39
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梦-妖精

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 12:53:39:
嗯.....................
       当然可以啊 10uM多加4倍体积就成了50uM啦
       没有必要检测cDNA 因为普通方法你也没法检测 如果不放心参照某些文献设计引物做3‘/5’完整度实验这是通用的检测cDNA方法

可是那样的话,整个体积就又变了啊,完全和试剂盒里要求的体积不一样了,那样会有影响吗???
3楼2012-05-23 14:59:56
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-23 20:51:38
检测cDNA,可以用Q3000测下浓度与吸光度值嘛。反转录的时候注意灭火一下就可以了,楼上已经回答的很详细了,个人感觉不必拘泥于试剂盒说明书剂量,体系的选择有可能要在试剂盒的基础上做改变的
4楼2012-05-23 17:28:48
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