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tutufei

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于RNA的问题

1.RNA电泳需要注意哪些，需要什么内参吗，我想要看下RNA提取的质量情况
2.如何去除RNA的DNA污染呢，我要进一步做RT-PCR,然后扩增目的条带，如果有DNA污染，就都能扩出来了
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1楼2011-03-16 09:24:02
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mafang68

金虫 (著名写手)
★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-03-16 09:47:27
tutufei(金币+1): 谢了 2011-03-21 21:22:37
RNA质量可以测OD260（好像是，记不清了）值，在1.8-2.0间好
不是有好几步洗的过程么，哪有那么多DNA啊
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2楼2011-03-16 09:38:26
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tangchaoxi

新虫 (小有名气)
tutufei(金币+1): 不是，手提哦 2011-03-21 21:23:28
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-03-16 09:24:02:
1.RNA电泳需要注意哪些，需要什么内参吗，我想要看下RNA提取的质量情况
2.如何去除RNA的DNA污染呢，我要进一步做RT-PCR,然后扩增目的条带，如果有DNA污染，就都能扩出来了

RNA电泳要用新的胶和新的电泳缓冲液，电泳槽什么的洗干净就可以了，RNA的质量主要还是RNA提取过程决定的。像楼上说的那样就行啦。你是用试剂盒吗？
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3楼2011-03-16 09:41:55
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nininini

银虫 (小有名气)
★
翱宇(金币+1): 不错，谢谢交流，DNA的消化应该还有一步抽提，补加DEPC水到400ul，以氯仿抽提就行了 2011-03-16 23:57:21
tutufei(金币+8): 谢谢 2011-03-21 21:35:36
电泳如楼上所说应该没问题，当然用ＤＥＰＣ处理过的水制胶及缓冲液应该会更好～～ＲＮＡ质量可以通过OD260/280，比例在1.8~2.再就是电泳看图了，28s/18s或23s/16s大约为2:1,
除DNA如果怕不干净的话可以用DNase消化一下，再除下蛋白，一般应该没问题，可以用RNA做下PCR验证是否有DNA污染
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4楼2011-03-16 10:18:26
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-16 09:41:55:
RNA电泳要用新的胶和新的电泳缓冲液，电泳槽什么的洗干净就可以了，RNA的质量主要还是RNA提取过程决定的。像楼上说的那样就行啦。你是用试剂盒吗？

手提的，用别人实验室的试剂（汗！），人家用biozol试剂处理植物，不知道能不能用来处理细菌，听说真核的mRNA比原核的稳定是吗，文献上有说细菌mRNA半衰期就几分钟，看人家提植物RNA很粗犷啊，跟提一般的DNA没两样，跑电泳也是跟一般的一样，哎，好不放心，还有有试剂盒说明书标明细菌用量1*107--5*108次方个是什么概念？好多问题啊，麻烦大家啦
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5楼2011-03-16 23:51:05
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
tutufei(金币+1): 谢了 2011-04-24 18:50:29
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-03-16 09:24:02:
1.RNA电泳需要注意哪些，需要什么内参吗，我想要看下RNA提取的质量情况
2.如何去除RNA的DNA污染呢，我要进一步做RT-PCR,然后扩增目的条带，如果有DNA污染，就都能扩出来了

首先RNA提取时特别注意要防止污染，你可以用核算定量仪看看OD值呀。一般2左右（+—0.1），可以电泳检测一下，主要看有带吗？不需要内参吧，你可以用B-actin参照一下。电泳结果你可以看出，一条带比较干净。做反转录试验时做好要做去除RNA中DNA的污染这步，加DNA酶1，DNAbuffer,DEPC,然后再加EDTA.
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6楼2011-03-19 17:06:28
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
tutufei(金币+5): thank you very much! 2011-03-21 21:32:42
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-03-16 23:51:05:
手提的，用别人实验室的试剂（汗！），人家用biozol试剂处理植物，不知道能不能用来处理细菌，听说真核的mRNA比原核的稳定是吗，文献上有说细菌mRNA半衰期就几分钟，看人家提植物RNA很粗犷啊，跟提一般的DNA没两 ...

Trizol can be used to isolate RNA from E coli  107-8 means od600 ---1-10
normaly 1 ml od600 =1 means you have 107 cells
everything should be new and freshly prepared,
I have more experience in RNA, if you have more questions just contact me
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7楼2011-03-21 19:03:47
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
1、最好用变性胶  可以上网查
2、提取时加入RNase-free 的DNaseI
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8楼2011-03-21 20:36:43
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-16 10:18:26:
电泳如楼上所说应该没问题，当然用ＤＥＰＣ处理过的水制胶及缓冲液应该会更好～～ＲＮＡ质量可以通过OD260/280，比例在1.8~2.再就是电泳看图了，28s/18s或23s/16s大约为2:1,
除DNA如果怕不干净的话可以用DNase消 ...

ＲＮＡOD260/280是用普通的紫外分光光度计检测吗？实验室的比色皿最少容量是1ml，而提取的RNA量很少的啊
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9楼2011-03-21 21:30:51
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)
东西搞干净点，主意卫生，按操作进行没问题的，呵呵，，，
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10楼2011-03-21 22:29:25
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lxjwishes

银虫 (正式写手)
消化一下DNA
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11楼2011-03-22 09:49:16
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Eva2009

禁虫 (初入文坛)
tutufei(金币+1): 谢了 2011-04-24 18:48:40
本帖内容被屏蔽
12楼2011-03-22 11:17:48
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nininini

银虫 (小有名气)
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-04-24 18:48:30
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-03-21 21:30:51:
ＲＮＡOD260/280是用普通的紫外分光光度计检测吗？实验室的比色皿最少容量是1ml，而提取的RNA量很少的啊

如果提取的浓度够大的话可以进行适当稀释~~有40微升的比色皿，不过我没用，就将RNA溶液稀释了15~30倍，使得读数在0.1~0.8，提取的RNA如果量太低就不合适用这种方法了，直接电泳估计浓度好了~
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13楼2011-03-23 10:01:51
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szylnl

银虫 (小有名气)
tutufei(金币+2): 谢谢 2011-04-24 18:47:26
我有个方法 或许可以在电泳时防止降解，胶新配，缓冲液用DEPC-水配，这些是必须的，我每次陪完胶，加好缓冲液之后，都将电泳槽放进超净台里用紫外照2个小时，这样基本上没有降解，5srRNA看不见，28是18的两倍左右。DNA污染的问题是听麻烦的，尤其是做RT的时候，所以还是要加DNA酶。
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14楼2011-03-23 10:27:50
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