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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】苦瓜各部分抽提总RNA所遇到的关于材料和试剂的问题
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thinkingers

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】苦瓜各部分抽提总RNA所遇到的关于材料和试剂的问题 已有4人参与

我最近正在学习抽提苦瓜中的总RNA，但是出现了很多问题，细说如下：

材料的问题。最开始我是抽取种子中的总RNA，按照标准的实验步骤做的，另外由于现在的室温很高，空调都是开到18度，但是实际上应该在22左右，甚至更高，抽出来的总RNA效果都还不错。

最近一段时间都是在抽取的果肉、根、茎、叶，以果肉为主。但是问题出现了。最后电泳（非变性）的结果显示都降解了，很多时候都是有一个没有降解，效果很好，但是另外一个或2个却降解了。刚开始以为是在最后溶解RNA的时候时间有点长（近5分钟而导致其余的都降解了），后来都是同时吸取千分之一的DEPC水再来溶解，结果还是这样。都有点迷茫了，似乎只有一个才是可以的，还有那个DEPC的水是早些时候配的，具体什么时候不记得了，我问过师兄，说是只要用DEPC处理过就OK了。

还有由于苦瓜从采摘下来到被买回实验室的间隔时间不知道有多少天。种子倒要好点，但是其余的部分说不定RNA就降解了，也无法知道啊。这个我主要是从其结构的功能来看的。比如果肉，没有成熟或者摘下以前，还是正常的发挥它的本来功能，但是一旦脱离那个环境后就不知道有什么变化了。而种子的功能是为了繁殖，所以会储存很多淀粉、蛋白质等生物大分子，就要转录，所以就有RNA了（？？），对于上面抽取果肉的RNA时出现的问题也怀疑过是时间问题，也请各位坛友发表下看法。

试剂及操作的问题。首先就是某些操作后要放置几分钟的问题。主要是：1，向Triol中加研磨的粉末后要剧烈摇晃（？）并且放置5分钟，充分裂解；2，之后加氯仿后也是剧烈摇晃（？）并且放置5分钟，这是我在这论坛上看到的；3，加异丙醇沉淀RNA后放置5分钟是为了充分沉淀；4，就是用75%乙醇洗过后晾干，由于基本上都是RNA，当其快没有乙醇的时候应该是很容易降解的吧，这个怎么办啊，还是就这样子的？以上这四点不知各位坛友有没有什么看法？？？
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1楼 2010-07-26 15:10:48
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黄大牛
amisking:严禁纯表情发帖！ 2010-07-26 20:51:04
2楼2010-07-26 19:14:40
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snowama

木虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
植物RNA提取就是很难的，我感觉一般都是在前边出问题。
首先是材料，一定要新鲜幼嫩的，可能含有大量的RNA的材料。而且不要贪多，使后续试剂都是足量的。
其次就是液氮研磨后尽快加入Trizol，对RNase的抑制如果不是靠液氮的 超低温，就要靠Trizol中的抑制成分了，两者的抑制作用要衔接上，不要给RNase可乘之机。
针对你的具体问题，我感觉前两个的“剧烈”没什么关系，而第三个沉淀应该是的，第四个一般只要在冰上，还不会那么快就降解的，否则就是试剂或容器污染RNase了

祝好运
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3楼2010-07-26 22:34:40
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thinkingers

金虫 (小有名气)
恩，我也感觉是前面比较容易出问题，后面就是单纯的添加试剂，步骤都很固定，基本上要出错的概率实在很小。
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4楼2010-07-27 12:34:08
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1、建议向研钵中加trizol，而不是将研磨的粉末加到trizol中，前者快，能最大程度避免rna降解
2、果肉部分含的多糖较多，可能需要一些添加试剂去多糖，
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5楼2010-07-27 12:56:30
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thinkingers

金虫 (小有名气)
哦，谢谢ls，我就是对于各部分组织可能富含什么的不太清楚，无法有针对性的去除之。有机会了试试
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6楼2010-07-28 09:47:06
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