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biology-girl

新虫 (正式写手)

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[求助] RNA 反转录后依然有内含子序列？已有3人参与

如题，最近克隆一个基因，但是有内含子，遂提取RNA 后反转录，可是测序结果回来后发现还是有内含子序列。请问各位大侠设施怎么回事？是我的方法操作有问题？还是NCBI 上公布的有问题（此基因以前没人克隆过） PS：没人克隆过那个基因，那NCBI 上的CDS 区是怎么得来的？是不是NCBI上的不对呀？

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1楼 2014-07-19 08:43:40

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 21:00:18

引用回帖:

14楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-22 11:19:43
EX taq 突变率太高了吧，这种预混酶我们只是为了菌落PCR 方便才用的，以前有师姐答辩的时候就被问到，尤其是后续要做突变和敲除，这种酶毫无说服力。连4K的阳性率很高？可能你们实验室比较厉害吧，至少我是第一次 ...

1.很多高保真酶3'5'外切活性很高的，扩出来平末端占绝大多数。你的高保真酶是哪个牌子的，确定有加A功能吗，我实验室都是用的LA taq加A效果很不错，保真性也可以，EXtaq其实也可以只要PCR的总反应时间控制住保真性还是可以的。
2.虽然没有连4K以上的，但是3.5K左右的也是经常做啊，连T载体效率很高的。你酶连的具体步骤如何，基因和载体都加了多少摩尔？