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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » RNA 反转录后依然有内含子序列？
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-21 09:21:07
我用的是高保真酶，我们实验室除了菌落PCR 没人用taq酶。很正常我的基因有4KB那么大，假阳性率当然高。...

ExTaq?确定是末端加A酶，我实验室也有连4K的基因，阳性率很高的。
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大家相互帮助哈
11楼2014-07-21 09:27:08
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volcanozhao
12楼2014-07-21 09:55:09
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lichao4214

新虫 (初入文坛)
学习了，都是大神
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13楼2014-07-22 10:06:50
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biology-girl

新虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 09:27:08
ExTaq?确定是末端加A酶，我实验室也有连4K的基因，阳性率很高的。...

EX taq 突变率太高了吧，这种预混酶我们只是为了菌落PCR 方便 才用的，以前有师姐答辩的时候就被问到，尤其是后续要做突变和敲除，这种酶毫无说服力。连4K的阳性率很高？ 可能你们实验室比较厉害吧，至少我是第一次听闻有这样的高手，要是有什么特殊技术还请赐教。
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14楼2014-07-22 11:19:43
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 21:00:18
引用回帖:
14楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-22 11:19:43
EX taq 突变率太高了吧，这种预混酶我们只是为了菌落PCR 方便 才用的，以前有师姐答辩的时候就被问到，尤其是后续要做突变和敲除，这种酶毫无说服力。连4K的阳性率很高？ 可能你们实验室比较厉害吧，至少我是第一次 ...

1.很多高保真酶3'5'外切活性很高的，扩出来平末端占绝大多数。你的高保真酶是哪个牌子的，确定有加A功能吗，我实验室都是用的LA taq加A效果很不错，保真性也可以，EXtaq其实也可以只要PCR的总反应时间控制住保真性还是可以的。
2.虽然没有连4K以上的，但是3.5K左右的也是经常做啊，连T载体效率很高的。你酶连的具体步骤如何，基因和载体都加了多少摩尔？
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大家相互帮助哈
15楼2014-07-22 15:06:18
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