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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-21 09:21:07
我用的是高保真酶,我们实验室除了菌落PCR 没人用taq酶。很正常我的基因有4KB那么大,假阳性率当然高。...

ExTaq?确定是末端加A酶,我实验室也有连4K的基因,阳性率很高的。
大家相互帮助哈
11楼2014-07-21 09:27:08
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12楼2014-07-21 09:55:09
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lichao4214

新虫 (初入文坛)

学习了,都是大神
13楼2014-07-22 10:06:50
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biology-girl

新虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 09:27:08
ExTaq?确定是末端加A酶,我实验室也有连4K的基因,阳性率很高的。...

EX taq 突变率太高了吧,这种预混酶我们只是为了菌落PCR 方便 才用的,以前有师姐答辩的时候就被问到,尤其是后续要做突变和敲除,这种酶毫无说服力。连4K的阳性率很高? 可能你们实验室比较厉害吧,至少我是第一次听闻有这样的高手,要是有什么特殊技术还请赐教。
14楼2014-07-22 11:19:43
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-07-27 21:00:18
引用回帖:
14楼: Originally posted by biology-girl at 2014-07-22 11:19:43
EX taq 突变率太高了吧,这种预混酶我们只是为了菌落PCR 方便 才用的,以前有师姐答辩的时候就被问到,尤其是后续要做突变和敲除,这种酶毫无说服力。连4K的阳性率很高? 可能你们实验室比较厉害吧,至少我是第一次 ...

1.很多高保真酶3'5'外切活性很高的,扩出来平末端占绝大多数。你的高保真酶是哪个牌子的,确定有加A功能吗,我实验室都是用的LA taq加A效果很不错,保真性也可以,EXtaq其实也可以只要PCR的总反应时间控制住保真性还是可以的。
2.虽然没有连4K以上的,但是3.5K左右的也是经常做啊,连T载体效率很高的。你酶连的具体步骤如何,基因和载体都加了多少摩尔?
大家相互帮助哈
15楼2014-07-22 15:06:18
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