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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问大片段怎么扩
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Ever希夷

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问大片段怎么扩 已有9人参与

构建好了质粒，但是目的片段将近8000bp，这种大片段用LA taq酶一直扩不出来，请问怎么办？
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1楼 2014-07-07 19:03:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 09:00:17
长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
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3楼2014-07-08 01:51:15
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
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advantage 2应该不成问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-07-07 19:25:34
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
更正：上贴的标题应为；“长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求”。
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4楼2014-07-08 02:05:25
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syx1983

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 16:14:45
可以分段扩增连接，也可以用长片段扩增方法，用KOD酶或者超高速的聚合酶，使用两步法。
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5楼2014-07-08 21:39:25
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通-仔

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有没有人做3'RACE 巢式PCR ?用的引物是简并引物，为什么我一直得不到条带？试剂盒有问题？但是对照能做出来我该怎么改进？求助。。。。谢谢
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6楼2014-07-08 22:08:24
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
8k还好吧，我经常扩11kb的，很轻松就扩出来了
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
7楼2014-07-08 22:17:56
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)
换个酶

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
8楼2014-07-08 22:52:56
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jamesfeng

铁虫 (初入文坛)
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-09 09:31:15
不管怎么样，先根据GC content stucture 先把引物设计好，设计引物是最为关键的，现在世面上买的酶纯度都很高，加上配套的buffer mix 或者buffer 镁离子，效率都很高，建议分成2kb左右的小片段，错配率会降低很多，最后再将片段整合在一起，这样碱基的缺失率就会降低，后续的定点突变也没那么麻烦
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9楼2014-07-08 23:58:11
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:26:21
Takara 有个GXL酶应该可以，您试一试！
引物您设计长一些，以增加特异性。
应该问题不大。
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10楼2014-07-09 10:44:53
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