| 查看: 2223 | 回复: 16 | ||||
[求助]
请问大片段怎么扩 已有9人参与
|
||||
| 构建好了质粒，但是目的片段将近8000bp，这种大片段用LA taq酶一直扩不出来，请问怎么办？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 | Vectors contribution |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有119人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 质粒PCR产物片段大小问题
已经有15人回复
- 如何确定自己的目的片段 PCR 痛苦中
已经有17人回复
- 关于设计克隆引物时产物片段大小有限制吗，如果我没有全长要怎么做能克隆到它的全长
已经有14人回复
- 紧！急！如何确定目的片段的长度
已经有4人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有23人回复
- PCR大片段问题
已经有15人回复
- 如何扩增GC含量较高的片段
已经有7人回复
- 求长片段（7.5 kb）PCR扩增方法？
已经有17人回复
- 我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀
已经有9人回复
- 短片段PCR扩增
已经有7人回复
- 5kb大片段PCR扩增求助
已经有18人回复
- 大片段DNA测序的问题
已经有7人回复
- 怎么计算DNA片段的大小是多少bp?
已经有4人回复
- 大片段PCR(2.1K)扩增求助
已经有12人回复
- 大片段连接问题
已经有20人回复
- PCR时出现了非目的片段的超大片段条带
已经有16人回复
- 反转录之后PCR扩增片段问题的请教，急急急
已经有5人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- 5--6KB的基因片段多长时间扩增？用什么样的酶好呢？
已经有15人回复
- 长片段DNA如何连接载体
已经有21人回复
- RT-PCR 试验中扩增片段大小？
已经有4人回复
- 【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段，咋办啊？？？？
已经有9人回复
- 【求助/交流】PCR扩增核心片段，再也扩不出来了，怎么办
已经有16人回复
- 【求助/交流】pfu扩出的片段回收后怎么加A
已经有12人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 09:00:17
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 09:00:17
|
长片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) |
3楼2014-07-08 01:51:15
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
2楼2014-07-07 19:25:34
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
4楼2014-07-08 02:05:25
syx1983
金虫 (正式写手)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 1692.3
- 散金: 138
- 红花: 2
- 帖子: 335
- 在线: 679.3小时
- 虫号: 693147
- 注册: 2009-01-15
- 性别: GG
- 专业: 高分子组装与超分子结构
5楼2014-07-08 21:39:25
6楼2014-07-08 22:08:24
jinpeng_6118
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 5027
- 散金: 25
- 红花: 2
- 帖子: 856
- 在线: 147.9小时
- 虫号: 1019189
- 注册: 2010-05-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
7楼2014-07-08 22:17:56
游侠892
铁杆木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 8246.4
- 散金: 76
- 红花: 6
- 帖子: 2102
- 在线: 138.9小时
- 虫号: 490693
- 注册: 2008-01-03
- 专业: 作物种质资源与遗传育种学
8楼2014-07-08 22:52:56
9楼2014-07-08 23:58:11
10楼2014-07-09 10:44:53
100