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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于设计克隆引物时产物片段大小有限制吗，如果我没有全长要怎么做能克隆到它的全长
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小沫沫188

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于设计克隆引物时产物片段大小有限制吗，如果我没有全长要怎么做能克隆到它的全长 已有2人参与

请问，1.设计克隆的引物，产物片段是不是太长就不好扩增啊？我在orf finder 比对阅读框，
显示完整的开放阅读框有4kbp左右，那么如果我要克隆这个基因的全长，怎么限定上下游引物呢，一定要在atg前taa后吗？克隆引物产物长度是不是不能太长？如果需要去掉里面的内含子怎么知道哪几段是内含子呢
2.如果一个基因我没有它的全长，只有部分序列，比如只有部分CDS序列，要怎么设计引物呢，听说要用到5“race，怎么感觉那么复杂，还请各位前辈赐教
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1楼 2014-04-08 14:44:27
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音四1990

铁虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-04-09 14:15:50
知道一部分序列，要扩全长，用RACE是最快的吧…… 只是RACE做起来，试剂盒会比较贵，不用试剂盒好像也可以，自己准备Oligo引物什么的也可以，我看到网上有不少大神总结的不用试剂盒做RACE的……都是牛人啊
用试剂盒的话，Smart和Takara的盒子用的人比较多，罗技的贵，国产有几个牌子，SuperSwitch的似乎还可以。
RACE引物一般设计两对，一个通用引物（好像是这名儿）一个巢式引物，试剂盒里会有说明，网上应该也能搜到，根据你已知的序列去找，要求无非也就是TM比较高，GC含量比较好，blah。
5‘RACE在反转录的时候，在cDNA的末端加上一个帽子结构，这样一来，相当于你已经知道了5’末端的序列，也知道一段中间的序列，然后中间设计一个引物，5‘用一个Oligo引物，PCR扩增就可以得到从已知序列到5’的全部序列了。
在第一轮PCR的时候，因为很多你的引物有可能跟不同基因都有结合，P出来的不一定都是你的目的基因，所以要进行第二轮nest，巢式引物比第一轮的引物更靠近5’。将第一轮的反应液回收，稀释，作为模板跑nest，这样在第二轮PCR中，得到的条带就一定是你的目的基因，接下来就克隆测序就行，如果不放心还可以设计更靠近5‘的第三轮引物。
关键是在做5’RACE的时候，RNA质量很重要，质量不好后面全部白费，在反转录时，cDNA有时候加不上帽子结构，后面也做不出来……PCR体系，热启动酶和模板多多少少都会有点影响……所以做RACE有时候会很头疼的……
我看论坛里各种前辈总结，如果RNA质量好，引物设计恰当，用比较好的试剂盒一周就能出结果的。
一个5‘RACE，一个3’RACE，两头测序结果一拼就得到基因全长了，很方便。
3‘RACE是利用Poly（A）尾，原理是一样的，3’比5‘好做。
我觉得RACE这种东西……有时候是要靠人品啊！

祝楼主好运啊！！
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我没那种命啊轮也不会轮到我
2楼2014-04-09 09:26:58
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然知道阅读框，直接从头到尾扩就得了

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3楼2014-04-09 12:42:22
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小沫沫188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-09 09:26:58
知道一部分序列，要扩全长，用RACE是最快的吧…… 只是RACE做起来，试剂盒会比较贵，不用试剂盒好像也可以，自己准备Oligo引物什么的也可以，我看到网上有不少大神总结的不用试剂盒做RACE的……都是牛人啊
用试剂盒 ...

额，感觉你说的好专业，好多我都不懂，谢谢啦，我还是初级，看来还是得多看看
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4楼2014-04-09 16:10:54
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小沫沫188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-09 12:42:22
既然知道阅读框，直接从头到尾扩就得了

设计引物要注意什么呢，实验室一个同学说扩增产物不能太长
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5楼2014-04-09 16:11:58
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小沫沫188 at 2014-04-09 16:11:58
设计引物要注意什么呢，实验室一个同学说扩增产物不能太长...

已知序列，不管多大，从头到尾扩就OK，引物温度不要太低，相差尽可能小

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-04-09 16:35:05
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小沫沫188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-09 16:35:05
已知序列，不管多大，从头到尾扩就OK，引物温度不要太低，相差尽可能小
...

能具体点不，对于知道序列的，设计引物肯定得要保证能扩出来全长吧，要限制上游引物在atg前下游在att后吗？
还有，那要是我只有它的CDS或者部分CDS序列该怎么办呢，只能做5’race吗
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7楼2014-04-09 16:53:18
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 小沫沫188 at 2014-04-09 16:53:18
能具体点不，对于知道序列的，设计引物肯定得要保证能扩出来全长吧，要限制上游引物在atg前下游在att后吗？
还有，那要是我只有它的CDS或者部分CDS序列该怎么办呢，只能做5’race吗...

有完整的cds就可以直接扩啦

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8楼2014-04-09 17:15:20
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小沫沫188 at 2014-04-09 16:10:54
额，感觉你说的好专业，好多我都不懂，谢谢啦，我还是初级，看来还是得多看看...

我也是初级……老板安排了任务要我自己去学……T T  泪目  完全自己摸索
其实原理懂了会觉得很简单 引物设计在很大程度上依靠经验
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我没那种命啊轮也不会轮到我
9楼2014-04-10 21:51:07
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小沫沫188 at 2014-04-09 16:11:58
设计引物要注意什么呢，实验室一个同学说扩增产物不能太长...

同问，要如何设计引物啊？
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10楼2014-04-16 10:10:50
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