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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】同源克隆设计的引物Tm值过低怎么办
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】同源克隆设计的引物Tm值过低怎么办

计算Tm值是否要考虑酶切序列和保护碱基，我的引物Tm值过低，怎么想办法提高呢？望指点
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1楼 2011-02-27 09:08:16
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
xnbioinfor(金币+1): 2011-02-27 12:56:27
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:36:33
Tm值的计算只考虑能够配对的部分，保护碱基一般不予考虑，酶切位点分情况。

你的引物才17bp啊，可以继续延长啊。

[ Last edited by brightfuture01 on 2011-2-27 at 11:19 ]
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2楼2011-02-27 11:18:19
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 11:18:19:
Tm值的计算只考虑能够配对的部分，保护碱基一般不予考虑，酶切位点分情况。

你的引物才17bp啊，可以继续延长啊。

[ Last edited by brightfuture01 on 2011-2-27 at 11:19 ]

引物合成清单上的Tm 难道不算保护碱基和酶切位点吗
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3楼2011-02-27 13:00:41
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walhp05

金虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
拿BB
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4楼2011-02-27 13:16:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-02-27 13:00:41:
引物合成清单上的Tm 难道不算保护碱基和酶切位点吗

呵呵，保护碱基在退火的时候会和模板结合么？

不结合当然不算了。
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5楼2011-02-27 13:27:24
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:27:24:
呵呵，保护碱基在退火的时候会和模板结合么？

不结合当然不算了。

扩增几个循环以后，不是保护碱基和酶切位点都互补了吗
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6楼2011-02-27 13:33:22
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-02-27 13:33:22:
扩增几个循环以后，不是保护碱基和酶切位点都互补了吗

呵呵，那你一开始的时候退火温度设置过高，岂非你的引物跟模板都不能结合？
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7楼2011-02-27 13:36:41
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:36:41:
呵呵，那你一开始的时候退火温度设置过高，岂非你的引物跟模板都不能结合？

一般Tm 值多少比较合适
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8楼2011-02-27 13:50:44
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:37:07
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-02-27 13:50:44:
一般Tm 值多少比较合适

看你是用来干嘛了，

Tm值高一般意味这引物比较长，特异性较好。所以如果在你从基因组中扩基因的话，需要将Tm设置高一点，55-65都是可以的。

比如我经常做表达截断的克隆，原本就是连在载体上的，这时候载体满满才5-6kb，所以一般15个bp的引物扩出来特异性都很高。这种情况下，就没有必要合成那么长的引物了。
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9楼2011-02-27 13:53:38
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-27 13:53:38:
看你是用来干嘛了，

Tm值高一般意味这引物比较长，特异性较好。所以如果在你从基因组中扩基因的话，需要将Tm设置高一点，55-65都是可以的。

比如我经常做表达截断的克隆，原本就是连在载体上的，这时候载 ...

我是克隆葡萄中一个cDNA的，引物17bp, Tm 41.1 有点低，是不是
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11楼2011-02-27 14:34:50
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-02-27 14:34:50:
我是克隆葡萄中一个cDNA的，引物17bp, Tm 41.1 有点低，是不是

恩，是比较低，呵呵，不能再延长几个bp了么？
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12楼2011-02-27 14:43:51
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hander3

新虫 (初入文坛)
★
xnbioinfor(金币+1): 谢谢参与
降低退火温度 巢式 PCR
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13楼2014-12-13 20:07:36
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lexiaoyao10楼
2011-02-27 14:08   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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