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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆表达 引物设计
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ljj0720

银虫 (正式写手)

[求助] 克隆表达 引物设计

急急急  现在我知道某基因的全长 要扩增全长 引物怎么设计啊  网上有这样说的：


1、从你的全长基因的正义链直接数出16-20个碱基（从ATG开始），然后在它的5‘端加上游酶切位点，如果需要的话加上保护碱基。
2、从你的全长基因的反义链从5’-3‘端直接数出16-20个碱基，后在它的5‘端加上游酶切位点，如果需要的话加上保护碱基。
这样引物就设计好了。
注意：上下游的酶切位点不要设计反了。



难道不用软件分析吗

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-5 at 09:46 ]
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1楼 2013-07-04 15:48:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 19:46:50
网上说的简单了点，差不多就是那个意思，不过要根据具体的基因来决定，比如长度太长（4-7kb），扩起来比较麻烦，还要保证高保真性也很难，测序也会很费劲。不过大部分都还好，简单来说，还是需要软件合适一点，软件会给出最佳的上下游引物组合，上游需要包括ATG，如果载体没有增强翻译的cozak序列，你自己最好加一个，下游要包含终止序列。扩增要用高保真酶。
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寻找真正的自我！
6楼2013-07-04 18:18:29
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普通回帖

bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不用软件么，开玩笑~~
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-07-04 15:51:26
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bleach060452

新虫 (小有名气)
他只是极其简单的一说，复杂的地方一点没提，优化才是最恶心的~~必须有软件辅助的
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岂能尽如人意，但求无愧我心
3楼2013-07-04 15:56:31
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refreshing11

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-04 17:02:15
分析的余地比较小，因为你的序列已经固定，两端的序列都要扩增出来，没法选择了，不过如果不得已，可以考虑简并引物的使用。希望有帮助

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-07-04 15:56:37
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 19:47:04
要分析的就是16-20个碱基那里的变化了。不过我会选择更长区域。下游引物可以选择在终止密码子后面，是不影响读码框的，还可以优化一下。
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为什么
5楼2013-07-04 18:06:49
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-04 15:56:31
他只是极其简单的一说，复杂的地方一点没提，优化才是最恶心的~~必须有软件辅助的

大侠 我设计出来了  您能帮我看一下吗？ 谢谢您
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    • 2013-07-04 18:18:31, 180.5 K
7楼2013-07-04 18:18:57
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-04 18:18:29
网上说的简单了点，差不多就是那个意思，不过要根据具体的基因来决定，比如长度太长（4-7kb），扩起来比较麻烦，还要保证高保真性也很难，测序也会很费劲。不过大部分都还好，简单来说，还是需要软件合适一点，软件 ...

这是我设计的 您能帮我看一下吗 谢谢
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    • 2013-07-04 18:20:35, 180.5 K
8楼2013-07-04 18:20:49
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2013-07-04 18:06:49
要分析的就是16-20个碱基那里的变化了。不过我会选择更长区域。下游引物可以选择在终止密码子后面，是不影响读码框的，还可以优化一下。

那如果选择密码子后面的碱基作为引物 那样扩增出来的  还是原来基因吗 我刚刚做  所以好多不懂  希望您可以指导一下 谢谢
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9楼2013-07-04 18:22:17
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lhs521521

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-04 18:20:49
这是我设计的 您能帮我看一下吗 谢谢...

不太好，最好不要这样可丁可卯的设计，可以向前和向后多延伸一些，只要包含就可以，上游和下游的引物还要加酶切位点呢！
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寻找真正的自我！
10楼2013-07-04 18:41:51
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