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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆表达 引物设计
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-04 18:41:51
不太好，最好不要这样可丁可卯的设计，可以向前和向后多延伸一些，只要包含就可以，上游和下游的引物还要加酶切位点呢！...

最好不要这样可丁可卯的设计是什么意思 您可以说的具体一点吗 谢谢 上游和下游的引物还要加酶切位点这个我知道 还要加保护碱基 。向前和向后多延伸一些  那扩增的还是我的基因全长吗
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11楼2013-07-04 18:55:19
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-04 18:41:51
不太好，最好不要这样可丁可卯的设计，可以向前和向后多延伸一些，只要包含就可以，上游和下游的引物还要加酶切位点呢！...

大侠帮忙解决一下吧  我已经整了几天了
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12楼2013-07-04 18:56:45
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-04 18:22:17
那如果选择密码子后面的碱基作为引物 那样扩增出来的  还是原来基因吗 我刚刚做  所以好多不懂  希望您可以指导一下 谢谢...

上下游引物一起来保证特异性，通常得到的还是原来的基因，只是比单纯的编码区长一些。
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为什么
13楼2013-07-04 19:10:52
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 547star at 2013-07-04 19:10:52
上下游引物一起来保证特异性，通常得到的还是原来的基因，只是比单纯的编码区长一些。...

我目的是要扩增出来后  做蛋白 比单纯的编码区长一些  那样能得到目的蛋白吗
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14楼2013-07-04 19:16:14
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-06 01:59:20
引用回帖:
14楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-04 19:16:14
我目的是要扩增出来后  做蛋白 比单纯的编码区长一些  那样能得到目的蛋白吗...

没问题。翻译的时候到终止密码子就结束了。天然的基因都能表达，你不过是扩增出来克隆到表达载体表达而已。克隆表达时要注意读码框正确。抽空补一下分子生物学的基础知识吧，欠缺太多，会有各种问题，这个时候读书效率比上论坛高很多。
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为什么
15楼2013-07-04 19:31:38
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 547star at 2013-07-04 19:31:38
没问题。翻译的时候到终止密码子就结束了。天然的基因都能表达，你不过是扩增出来克隆到表达载体表达而已。克隆表达时要注意读码框正确。抽空补一下分子生物学的基础知识吧，欠缺太多，会有各种问题，这个时候读书 ...

嗯 好的 谢谢
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16楼2013-07-04 19:36:09
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lhs521521

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-04 18:56:45
大侠帮忙解决一下吧  我已经整了几天了 ...

不好意思，刚才有事出去了，解决了吗？
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寻找真正的自我！
17楼2013-07-04 21:13:10
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小love肖

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 14:56:18
你的序列中GC含量太少了，上下游引物中GC含量更少，估计不太好扩增，你可以选择载体上的序列设计引物先扩增，然后再酶切下来你要的序列再克隆就行了，下面是我设计的引物，有点长，但是也没办法，你可以看看
上游引物   （保护碱基）酶切位点+GCCGCCACC+atgagttttaggataaatac（5‘-3’）
下游引物      （保护碱基）酶切位点+ TTATTGTAAAAGCCTTAAGAC（5‘-3’）
GC含量在30左右，Tm值为40
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18楼2013-07-05 12:38:07
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-04 21:13:10
不好意思，刚才有事出去了，解决了吗？...

还没有
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19楼2013-07-05 21:27:58
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-07-05 12:38:07
你的序列中GC含量太少了，上下游引物中GC含量更少，估计不太好扩增，你可以选择载体上的序列设计引物先扩增，然后再酶切下来你要的序列再克隆就行了，下面是我设计的引物，有点长，但是也没办法，你可以看看
上游引 ...

谢谢大侠  下游引物我看懂了  但是上游引物 +GCCGCCACC是怎么来的  它不是基因序列里面的  能作为引物吗  如果能 那么扩增来  不就不是我原来的序列了吗
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20楼2013-07-05 21:30:55
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