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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆表达 引物设计
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lhs521521

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-05 21:27:58
还没有...

可以给我此基因的mRNA序列吗，包括3‘UTR和5’UTR!
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寻找真正的自我！
21楼2013-07-06 08:49:16
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小飞8675

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 热心的虫子！ 2013-07-07 17:51:41
http://www.med66.com/html/ziliao ... 7ec21b090eb5cbc.htm

这个链接 告诉扩增cDNA全长，并加上双酶切位点，保护碱基，请看一下
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worthy is the lamb
22楼2013-07-06 15:15:15
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 小飞8675 at 2013-07-06 15:15:15
http://www.med66.com/html/ziliao/yixue/10/1f89a6014e659ecc77ec21b090eb5cbc.htm

这个链接 告诉扩增cDNA全长，并加上双酶切位点，保护碱基，请看一下

谢谢  那在这个链接里面 你有没有发现上游有一个碱基是对不上的
vpr基因：方向5’-----3‘
ATGGAACAATCCCCAGAAGATCAGGGGCCGCAGAGGGAACCACACAATGAATGGACACTA
GAGCTTCTAGAGGAGCTCAAGCAGGAAGCTGTCAGACACTTTCCTAGACCATGGCTTCAT
AGCTTAGGACAACATATCTATGACACATACGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATA
ATAAGAACTCTGCAACAACTGCTGTTTATTCATTTCAGAATTGGGTGTCAGCATAGCAGA
ATAGGTATTTTGAGACAGAGAAGAACAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAA

vpr-上游 5-CCCaagctt（保护碱基加酶切） ATGGAACAAGCCCCAGAAGA
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23楼2013-07-06 20:50:27
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-06 08:49:16
可以给我此基因的mRNA序列吗，包括3‘UTR和5’UTR!...

谢谢 我刚刚看见您的回复  我有DNA序列 是原核生物
ORIGIN      
        1 atgagtttta ggataaatac caatatcgcc gctttaactt ctcatgcggt aggggttcaa
       61 aacaacagag acctttcaag ctcgcttgaa aagttaagct cagggcttag gatcaataaa
      121 gccgctgacg attctagtgg gatggcgatc gctgatagct taaggagtca aagcgcgaat
      181 ttgggtcaag cgatccgcaa cgctaatgac gctattggta tggttcaaac cgcagataaa
      241 gcgatggatg agcaaatcaa aatcttagac accattaaaa ccaaagccgt tcaagccgct
      301 caagacgggc aaactttaga aagccgaaga gccctccaga gcgatattca aaggttgtta
      361 gaagaactag acaatatcgc taacaccaca agctttaacg gccaacaaat gctttcagga
      421 agtttttcta acaaagaatt tcaaattggc gcgtattcta acaccacggt taaggcgtct
      481 attggctcaa cgagctcaga taagattggg catgtgcgca tggaaacttc ttcttttagc
      541 ggtgcaggca tgctcgctag cgcagcggcg caaaacttga ctgaagtggg attgaatttc
      601 aaacaagtca atggcgtgaa cgattataag attgaaaccg tgcgcatttc tacgagtgct
      661 ggcactggga ttggagcgtt aagcgaaatc atcaaccgct tttctaacac cttaggcgtt
      721 agggcctctt ataatgtcat ggccaccggt ggcactcccg tgcaatcagg aactgttagg
      781 gagctcacca ttaatggcgt agaaattggg accgtgaatg atgtgcataa aaacgacgct
      841 gacgggaggt tgactaacgc cattaactcc gtcaaagatc gcaccggcgt ggaagcgagc
      901 ttggatattc aagggcgcat taatttgcac tccattgacg ggcgcgcgat ttctgtgcat
      961 gcagcgagcg cgagcggtca ggtttttggg ggagggaatt ttgcagggat ttctgggaca
     1021 cagcatgcgg ttattgggcg cttaaccttg actaggaccg acgctagaga catcattgta
     1081 agcggtgtga attttagcca tgtgggcttt cattccgctc aaggggtggc agaatacacc
     1141 gtgaatttga gagcggttag gggtattttt gatgcgaatg tggcttcagc agccggagcg
     1201 aacgctaatg gcgcgcaagc ggagaccaat tctcaaggta taggggctgg ggtaacaagc
     1261 cttaaagggg cgatgattgt gatggatatg gcggattcag cgcgcacgca attagacaag
     1321 atccgctcgg atatgggttc ggtgcaaatg gaattggtta caaccattaa taatatttct
     1381 gtaacccaag tgaatgttaa agcggctgaa tctcaaatca gagatgtgga ttttgctgaa
     1441 gagagcgcaa acttttctaa atacaatatt ttggcgcaaa gcgggagttt tgctatggcg
     1501 caagcgaatg cggtgcaaca aaatgtctta aggcttttac aataa
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24楼2013-07-06 20:54:04
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 感谢应助！ 2013-07-07 17:52:16
设计个引物都这么纠结。
对于楼主这种扩增基因全长的情况，一般只能从起始密码子开始设计上游引物，从终止密码子设计下游引物，而且必须要借助软件来评价引物之间的二级结构、引物二聚体和错配情况，尤其要注意错配率不要太高。当然，错配、二聚体、二级结构等是不可能都完全消除防护，但是可以通过改变上下游引物长度来尽可能的是的他们的自由能绝对值最小化。
设计引物的时候考虑好是否要加入tag和酶切位点，同时要注意不要移码。
建议楼主google一下，引物的设计相关资料。
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25楼2013-07-07 00:11:59
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lhs521521

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-06 20:54:04
谢谢 我刚刚看见您的回复  我有DNA序列 是原核生物
ORIGIN      
        1 atgagtttta ggataaatac caatatcgcc gctttaactt ctcatgcggt aggggttcaa
       61 aacaacagag acctttcaag ctcgcttgaa aagttaagct cagg ...

ATG上游和TAA下游的序列还有吗？最好全给我！
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寻找真正的自我！
26楼2013-07-07 08:01:22
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小love肖

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

GCCGCCACC是kozak序列，我们一直用这个，后面接ATG，对于PCR扩增是极好的
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27楼2013-07-08 08:41:56
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-07 08:01:22
ATG上游和TAA下游的序列还有吗？最好全给我！...

嗯 刚刚看见  谢谢
ORIGIN      
        1 tttatccaaa aaatttttaa ttgttttggc ttttgcgggg gattctacga taataaggtg
       61 cttcattgaa cgcctttaat aaaatgttta tacctattaa tgaatgattg tagcatagaa
      121 ttttgactaa acgattcatt aaaccataaa aactataacg gcgctaaaaa tcaaagagtt
      181 ggaacaccct ttgcttgact aacagcaaat atctatgcaa aggatgcaaa catgagtttt
      241 aggataaata ccaatatcgc cgctttaact tctcatgcgg taggggttca aaacaacaga
      301 gacctttcaa gctcgcttga aaagttaagc tcagggctta ggatcaataa agccgctgac
      361 gattctagtg ggatggcgat cgctgatagc ttaaggagtc aaagcgcgaa tttgggtcaa
      421 gcgatccgca acgctaatga cgctattggt atggttcaaa ccgcagataa agcgatggat
      481 gagcaaatca aaatcttaga caccattaaa accaaagccg ttcaagccgc tcaagacggg
      541 caaactttag aaagccgaag agccctccag agcgatattc aaaggttgtt agaagaacta
      601 gacaatatcg ctaacaccac aagctttaac ggccaacaaa tgctttcagg aagtttttct
      661 aacaaagaat ttcaaattgg cgcgtattct aacaccacgg ttaaggcgtc tattggctca
      721 acgagctcag ataagattgg gcatgtgcgc atggaaactt cttcttttag cggtgcaggc
      781 atgctcgcta gcgcagcggc gcaaaacttg actgaagtgg gattgaattt caaacaagtc
      841 aatggcgtga acgattataa gattgaaacc gtgcgcattt ctacgagtgc tggcactggg
      901 attggagcgt taagcgaaat catcaaccgc ttttctaaca ccttaggcgt tagggcctct
      961 tataatgtca tggccaccgg tggcactccc gtgcaatcag gaactgttag ggagctcacc
     1021 attaatggcg tagaaattgg gaccgtgaat gatgtgcata aaaacgacgc tgacgggagg
     1081 ttgactaacg ccattaactc cgtcaaagat cgcaccggcg tggaagcgag cttggatatt
     1141 caagggcgca ttaatttgca ctccattgac gggcgcgcga tttctgtgca tgcagcgagc
     1201 gcgagcggtc aggtttttgg gggagggaat tttgcaggga tttctgggac acagcatgcg
     1261 gttattgggc gcttaacctt gactaggacc gacgctagag acatcattgt aagcggtgtg
     1321 aattttagcc atgtgggctt tcattccgct caaggggtgg cagaatacac cgtgaatttg
     1381 agagcggtta ggggtatttt tgatgcgaat gtggcttcag cagccggagc gaacgctaat
     1441 ggcgcgcaag cggagaccaa ttctcaaggt ataggggctg gggtaacaag ccttaaaggg
     1501 gcgatgattg tgatggatat ggcggattca gcgcgcacgc aattagacaa gatccgctcg
     1561 gatatgggtt cggtgcaaat ggaattggtt acaaccatta ataatatttc tgtaacccaa
     1621 gtgaatgtta aagcggctga atctcaaatc agagatgtgg attttgctga agagagcgca
     1681 aacttttcta aatacaatat tttggcgcaa agcgggagtt ttgctatggc gcaagcgaat
     1741 gcggtgcaac aaaatgtctt aaggctttta caataacagc ccttttaatt caaaggggcg
     1801 ttagcccttt ttataagtta gaacgatgga tatttatcaa aaaaacttgc aagctctttt
     1861 caaaaaagac cctcttttgt tcgcaaagct caaagccatt aaagaaaaca aaaaatacga
     1921 agtgttttta gggaatgata gcgcgaattt caacctctta gataaagaaa caaacacgcc
     1981 cttatttgaa aaaagcccgc tagattcaa
这是原基因 谢谢 您
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28楼2013-07-08 15:57:52
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

F: ATCAAAGAGTTGGAACACCCTT  22bp   TM: 59
R: GCTATCATTCCCTAAAAACACT  22bp    TM: 54.5
product length: 1773bp

上游和下游加上你要连接到载体上的酶切位点！
我也不知道扩增效果如何，仅供参考！
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寻找真正的自我！
29楼2013-07-08 18:08:10
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ljj0720

银虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-08 18:08:10
F: ATCAAAGAGTTGGAACACCCTT  22bp   TM: 59
R: GCTATCATTCCCTAAAAACACT  22bp    TM: 54.5
product length: 1773bp

上游和下游加上你要连接到载体上的酶切位点！
我也不知道扩增效果如何，仅供参考！

大侠 这样做  我只有一个问题解决不了   product length: 1773bp
扩增产物已经不是原来我的基因全长了 那样行吗 我P样的目的就是为了扩增我的基因全长 这样不就是已经变了吗？
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30楼2013-07-09 07:12:26
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