【答案】应助回帖

寻找真正的自我！

21楼2013-07-06 08:49:16

小飞8675

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 热心的虫子！ 2013-07-07 17:51:41

http://www.med66.com/html/ziliao ... 7ec21b090eb5cbc.htm

这个链接告诉扩增cDNA全长，并加上双酶切位点，保护碱基，请看一下

worthy is the lamb

22楼2013-07-06 15:15:15

ljj0720

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引用回帖:

22楼: Originally posted by 小飞8675 at 2013-07-06 15:15:15
http://www.med66.com/html/ziliao/yixue/10/1f89a6014e659ecc77ec21b090eb5cbc.htm

这个链接告诉扩增cDNA全长，并加上双酶切位点，保护碱基，请看一下

谢谢那在这个链接里面你有没有发现上游有一个碱基是对不上的
vpr基因：方向5’-----3‘
ATGGAACAATCCCCAGAAGATCAGGGGCCGCAGAGGGAACCACACAATGAATGGACACTA
GAGCTTCTAGAGGAGCTCAAGCAGGAAGCTGTCAGACACTTTCCTAGACCATGGCTTCAT
AGCTTAGGACAACATATCTATGACACATACGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATA
ATAAGAACTCTGCAACAACTGCTGTTTATTCATTTCAGAATTGGGTGTCAGCATAGCAGA
ATAGGTATTTTGAGACAGAGAAGAACAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAA

vpr-上游 5-CCCaagctt（保护碱基加酶切） ATGGAACAAGCCCCAGAAGA

23楼2013-07-06 20:50:27

ljj0720

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引用回帖:

21楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-06 08:49:16
可以给我此基因的mRNA序列吗，包括3‘UTR和5’UTR!...

谢谢我刚刚看见您的回复  我有DNA序列是原核生物
ORIGIN
      1 atgagtttta ggataaatac caatatcgcc gctttaactt ctcatgcggt aggggttcaa
   61 aacaacagag acctttcaag ctcgcttgaa aagttaagct cagggcttag gatcaataaa
   121 gccgctgacg attctagtgg gatggcgatc gctgatagct taaggagtca aagcgcgaat
   181 ttgggtcaag cgatccgcaa cgctaatgac gctattggta tggttcaaac cgcagataaa
   241 gcgatggatg agcaaatcaa aatcttagac accattaaaa ccaaagccgt tcaagccgct
   301 caagacgggc aaactttaga aagccgaaga gccctccaga gcgatattca aaggttgtta
   361 gaagaactag acaatatcgc taacaccaca agctttaacg gccaacaaat gctttcagga
   421 agtttttcta acaaagaatt tcaaattggc gcgtattcta acaccacggt taaggcgtct
   481 attggctcaa cgagctcaga taagattggg catgtgcgca tggaaacttc ttcttttagc
   541 ggtgcaggca tgctcgctag cgcagcggcg caaaacttga ctgaagtggg attgaatttc
   601 aaacaagtca atggcgtgaa cgattataag attgaaaccg tgcgcatttc tacgagtgct
   661 ggcactggga ttggagcgtt aagcgaaatc atcaaccgct tttctaacac cttaggcgtt
   721 agggcctctt ataatgtcat ggccaccggt ggcactcccg tgcaatcagg aactgttagg
   781 gagctcacca ttaatggcgt agaaattggg accgtgaatg atgtgcataa aaacgacgct
   841 gacgggaggt tgactaacgc cattaactcc gtcaaagatc gcaccggcgt ggaagcgagc
   901 ttggatattc aagggcgcat taatttgcac tccattgacg ggcgcgcgat ttctgtgcat
   961 gcagcgagcg cgagcggtca ggtttttggg ggagggaatt ttgcagggat ttctgggaca
   1021 cagcatgcgg ttattgggcg cttaaccttg actaggaccg acgctagaga catcattgta
   1081 agcggtgtga attttagcca tgtgggcttt cattccgctc aaggggtggc agaatacacc
   1141 gtgaatttga gagcggttag gggtattttt gatgcgaatg tggcttcagc agccggagcg
   1201 aacgctaatg gcgcgcaagc ggagaccaat tctcaaggta taggggctgg ggtaacaagc
   1261 cttaaagggg cgatgattgt gatggatatg gcggattcag cgcgcacgca attagacaag
   1321 atccgctcgg atatgggttc ggtgcaaatg gaattggtta caaccattaa taatatttct
   1381 gtaacccaag tgaatgttaa agcggctgaa tctcaaatca gagatgtgga ttttgctgaa
   1441 gagagcgcaa acttttctaa atacaatatt ttggcgcaaa gcgggagttt tgctatggcg
   1501 caagcgaatg cggtgcaaca aaatgtctta aggcttttac aataa

24楼2013-07-06 20:54:04

zhouking8758

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gyesang: 金币+2, 感谢应助！ 2013-07-07 17:52:16

设计个引物都这么纠结。
对于楼主这种扩增基因全长的情况，一般只能从起始密码子开始设计上游引物，从终止密码子设计下游引物，而且必须要借助软件来评价引物之间的二级结构、引物二聚体和错配情况，尤其要注意错配率不要太高。当然，错配、二聚体、二级结构等是不可能都完全消除防护，但是可以通过改变上下游引物长度来尽可能的是的他们的自由能绝对值最小化。
设计引物的时候考虑好是否要加入tag和酶切位点，同时要注意不要移码。
建议楼主google一下，引物的设计相关资料。

25楼2013-07-07 00:11:59

lhs521521

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引用回帖:

24楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-06 20:54:04
谢谢我刚刚看见您的回复  我有DNA序列是原核生物
ORIGIN
      1 atgagtttta ggataaatac caatatcgcc gctttaactt ctcatgcggt aggggttcaa
   61 aacaacagag acctttcaag ctcgcttgaa aagttaagct cagg ...

ATG上游和TAA下游的序列还有吗？最好全给我！

寻找真正的自我！

26楼2013-07-07 08:01:22

小love肖

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【答案】应助回帖

GCCGCCACC是kozak序列，我们一直用这个，后面接ATG，对于PCR扩增是极好的

27楼2013-07-08 08:41:56

ljj0720

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引用回帖:

26楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-07 08:01:22
ATG上游和TAA下游的序列还有吗？最好全给我！...

嗯刚刚看见  谢谢
ORIGIN
      1 tttatccaaa aaatttttaa ttgttttggc ttttgcgggg gattctacga taataaggtg
   61 cttcattgaa cgcctttaat aaaatgttta tacctattaa tgaatgattg tagcatagaa
   121 ttttgactaa acgattcatt aaaccataaa aactataacg gcgctaaaaa tcaaagagtt
   181 ggaacaccct ttgcttgact aacagcaaat atctatgcaa aggatgcaaa catgagtttt
   241 aggataaata ccaatatcgc cgctttaact tctcatgcgg taggggttca aaacaacaga
   301 gacctttcaa gctcgcttga aaagttaagc tcagggctta ggatcaataa agccgctgac
   361 gattctagtg ggatggcgat cgctgatagc ttaaggagtc aaagcgcgaa tttgggtcaa
   421 gcgatccgca acgctaatga cgctattggt atggttcaaa ccgcagataa agcgatggat
   481 gagcaaatca aaatcttaga caccattaaa accaaagccg ttcaagccgc tcaagacggg
   541 caaactttag aaagccgaag agccctccag agcgatattc aaaggttgtt agaagaacta
   601 gacaatatcg ctaacaccac aagctttaac ggccaacaaa tgctttcagg aagtttttct
   661 aacaaagaat ttcaaattgg cgcgtattct aacaccacgg ttaaggcgtc tattggctca
   721 acgagctcag ataagattgg gcatgtgcgc atggaaactt cttcttttag cggtgcaggc
   781 atgctcgcta gcgcagcggc gcaaaacttg actgaagtgg gattgaattt caaacaagtc
   841 aatggcgtga acgattataa gattgaaacc gtgcgcattt ctacgagtgc tggcactggg
   901 attggagcgt taagcgaaat catcaaccgc ttttctaaca ccttaggcgt tagggcctct
   961 tataatgtca tggccaccgg tggcactccc gtgcaatcag gaactgttag ggagctcacc
   1021 attaatggcg tagaaattgg gaccgtgaat gatgtgcata aaaacgacgc tgacgggagg
   1081 ttgactaacg ccattaactc cgtcaaagat cgcaccggcg tggaagcgag cttggatatt
   1141 caagggcgca ttaatttgca ctccattgac gggcgcgcga tttctgtgca tgcagcgagc
   1201 gcgagcggtc aggtttttgg gggagggaat tttgcaggga tttctgggac acagcatgcg
   1261 gttattgggc gcttaacctt gactaggacc gacgctagag acatcattgt aagcggtgtg
   1321 aattttagcc atgtgggctt tcattccgct caaggggtgg cagaatacac cgtgaatttg
   1381 agagcggtta ggggtatttt tgatgcgaat gtggcttcag cagccggagc gaacgctaat
   1441 ggcgcgcaag cggagaccaa ttctcaaggt ataggggctg gggtaacaag ccttaaaggg
   1501 gcgatgattg tgatggatat ggcggattca gcgcgcacgc aattagacaa gatccgctcg
   1561 gatatgggtt cggtgcaaat ggaattggtt acaaccatta ataatatttc tgtaacccaa
   1621 gtgaatgtta aagcggctga atctcaaatc agagatgtgg attttgctga agagagcgca
   1681 aacttttcta aatacaatat tttggcgcaa agcgggagtt ttgctatggc gcaagcgaat
   1741 gcggtgcaac aaaatgtctt aaggctttta caataacagc ccttttaatt caaaggggcg
   1801 ttagcccttt ttataagtta gaacgatgga tatttatcaa aaaaacttgc aagctctttt
   1861 caaaaaagac cctcttttgt tcgcaaagct caaagccatt aaagaaaaca aaaaatacga
   1921 agtgttttta gggaatgata gcgcgaattt caacctctta gataaagaaa caaacacgcc
   1981 cttatttgaa aaaagcccgc tagattcaa
这是原基因谢谢您

28楼2013-07-08 15:57:52

lhs521521

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专业: 细胞增殖、生长与分化

【答案】应助回帖

F: ATCAAAGAGTTGGAACACCCTT 22bp TM: 59
R: GCTATCATTCCCTAAAAACACT 22bp TM: 54.5
product length: 1773bp

上游和下游加上你要连接到载体上的酶切位点！
我也不知道扩增效果如何，仅供参考！

寻找真正的自我！

29楼2013-07-08 18:08:10

ljj0720

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引用回帖:

29楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-08 18:08:10
F: ATCAAAGAGTTGGAACACCCTT 22bp TM: 59
R: GCTATCATTCCCTAAAAACACT 22bp TM: 54.5
product length: 1773bp

上游和下游加上你要连接到载体上的酶切位点！
我也不知道扩增效果如何，仅供参考！

大侠这样做我只有一个问题解决不了 product length: 1773bp
扩增产物已经不是原来我的基因全长了那样行吗我P样的目的就是为了扩增我的基因全长这样不就是已经变了吗？

30楼2013-07-09 07:12:26