| 查看: 2996 | 回复: 14 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
关于设计克隆引物时产物片段大小有限制吗，如果我没有全长要怎么做能克隆到它的全长 已有2人参与
|
||
|
请问，1.设计克隆的引物，产物片段是不是太长就不好扩增啊？我在orf finder 比对阅读框， 显示完整的开放阅读框有4kbp左右，那么如果我要克隆这个基因的全长，怎么限定上下游引物呢，一定要在atg前taa后吗？克隆引物产物长度是不是不能太长？如果需要去掉里面的内含子怎么知道哪几段是内含子呢 2.如果一个基因我没有它的全长，只有部分序列，比如只有部分CDS序列，要怎么设计引物呢，听说要用到5“race，怎么感觉那么复杂，还请各位前辈赐教 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有181人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 我想做两个基因的融合克隆表达，怎么设计引物使两个基因融合啊？
已经有4人回复
- 求助转录组测序完成后，后续荧光定量、基因克隆引物设计问题
已经有8人回复
- 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢？
已经有7人回复
- 引物设计——下游引物是否需要考虑阅读框问题
已经有6人回复
- 已知cds序列如何设计引物克隆全长
已经有4人回复
- 克隆表达 引物设计
已经有31人回复
- 关于PCR引物中加入酶切位点的设计方法和酶切问题！ 新手，求帮忙！！
已经有4人回复
- 从头设计引物克隆全长基因
已经有22人回复
- PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？
已经有13人回复
- 克隆基因可以用起始位点上游或终止位点后面的碱基设计引物吗？
已经有3人回复
- 直接PCR产物转化的克隆新方法，不需要限制酶和连接酶（正式出版pdf版）
已经有78人回复
- 如何设计引物扩增片段？做克隆的
已经有11人回复
- 问问pet-28a克隆构建引物的问题
已经有12人回复
- 求助-基因克隆及引物设计的问题
已经有6人回复
- 克隆大片段的序列如何设计引物
已经有4人回复
- 【求助/交流】同源克隆设计的引物Tm值过低怎么办
已经有12人回复
- 【求助/交流】核基因 PCR产物直接测序，结果出现单个位点套峰，是否需要做克隆测序
已经有9人回复
- 【求助/交流】基因克隆设计引物
已经有7人回复
- 【求助】求教基因克隆中的引物设计问题【有效期至2010年11月18日】
已经有6人回复
- 【求助/交流】PCR产物切胶回收后可不可以加A尾,做TA克隆，急！希望高手们能帮帮忙！
已经有9人回复
- 【求助/交流】问个问题,测PCR产物序列的时候会不会测出引物的序列?
已经有16人回复
- 克隆基因全长引物设计问题
已经有32人回复
4楼2014-04-09 16:10:54
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-04-09 14:15:50
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-04-09 14:15:50
|
知道一部分序列，要扩全长，用RACE是最快的吧…… 只是RACE做起来，试剂盒会比较贵，不用试剂盒好像也可以，自己准备Oligo引物什么的也可以，我看到网上有不少大神总结的不用试剂盒做RACE的……都是牛人啊 用试剂盒的话，Smart和Takara的盒子用的人比较多，罗技的贵，国产有几个牌子，SuperSwitch的似乎还可以。 RACE引物一般设计两对，一个通用引物（好像是这名儿）一个巢式引物，试剂盒里会有说明，网上应该也能搜到，根据你已知的序列去找，要求无非也就是TM比较高，GC含量比较好，blah。 5‘RACE在反转录的时候，在cDNA的末端加上一个帽子结构，这样一来，相当于你已经知道了5’末端的序列，也知道一段中间的序列，然后中间设计一个引物，5‘用一个Oligo引物，PCR扩增就可以得到从已知序列到5’的全部序列了。 在第一轮PCR的时候，因为很多你的引物有可能跟不同基因都有结合，P出来的不一定都是你的目的基因，所以要进行第二轮nest，巢式引物比第一轮的引物更靠近5’。将第一轮的反应液回收，稀释，作为模板跑nest，这样在第二轮PCR中，得到的条带就一定是你的目的基因，接下来就克隆测序就行，如果不放心还可以设计更靠近5‘的第三轮引物。 关键是在做5’RACE的时候，RNA质量很重要，质量不好后面全部白费，在反转录时，cDNA有时候加不上帽子结构，后面也做不出来……PCR体系，热启动酶和模板多多少少都会有点影响……所以做RACE有时候会很头疼的…… 我看论坛里各种前辈总结，如果RNA质量好，引物设计恰当，用比较好的试剂盒一周就能出结果的。 一个5‘RACE，一个3’RACE，两头测序结果一拼就得到基因全长了，很方便。 3‘RACE是利用Poly（A）尾，原理是一样的，3’比5‘好做。 我觉得RACE这种东西……有时候是要靠人品啊！ 祝楼主好运啊！！ |
2楼2014-04-09 09:26:58
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-04-09 12:42:22
5楼2014-04-09 16:11:58
10