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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计——下游引物是否需要考虑阅读框问题
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颜小泡泡

新虫 (初入文坛)

[求助] 引物设计——下游引物是否需要考虑阅读框问题

如题，本人是分子生物学小菜鸟一枚，最近刚学习如何设计引物，非常困惑。。。
请问大家，在设计上游引物的时候，起始密码子ATG的阅读框是要格外注意的，不能在加完酶切位点之后把阅读框破坏掉
那么下游引物是否需要考虑阅读框的问题呢？如果加完下游酶切位点，阅读框被破坏了，是否也需要补加碱基

还有，补加的碱基会不会影响目的基因所合成的蛋白质的表达呢。。

最后一个问题，下游引物是否需要考虑加入终止密码子呢，谢谢各位了！
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1楼2013-11-10 16:41:12
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★ ★
amisking: 金币+2, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-11-10 18:43:00
首先根据你最后一个问题，说明你还没有明白PCR的机制，或者说是没有用自己的理解来消化。引物的设计不需要启动子和终止子，PCR产物的长短大小，完全取决于你设计的引物与目的DNA的同源型结合位点。
再来，你说上游别破坏了阅读框，那么下游也就不会破坏了，上下游引物是互补的两条链的引物，，，说的有点复杂，有问题可以线上继续讨论。
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我不会！
2楼2013-11-10 18:17:30
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颜小泡泡

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-11-10 18:17:30
首先根据你最后一个问题，说明你还没有明白PCR的机制，或者说是没有用自己的理解来消化。引物的设计不需要启动子和终止子，PCR产物的长短大小，完全取决于你设计的引物与目的DNA的同源型结合位点。
再来，你说上游 ...

谢谢回复

我的意思是，扩一整个基因的时候，基因自己会带启动子和终止子对吗，不用我额外再加了？
我知道上下游是互补的两条链的引物，但是我不明白，下游引物在扩增的时候，如果我的酶切位点和补加碱基不是3的倍数，会不会让基因错位
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3楼2013-11-10 19:41:48
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-10 22:59:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by 颜小泡泡 at 2013-11-10 19:41:48
谢谢回复

我的意思是，扩一整个基因的时候，基因自己会带启动子和终止子对吗，不用我额外再加了？
我知道上下游是互补的两条链的引物，但是我不明白，下游引物在扩增的时候，如果我的酶切位点和补加碱基不是3的 ...

说句实话，PCR引物的设计问题很微妙。如果按照引物设计原则设计出一个纸面上完美无暇的，在实际应用中往往就不一定好用，反之亦然。这对新手来说很头痛，很多情况下是根据经验而定。你的扩一整个基因？是说一个完整酶或者蛋白的编码基因吧？这个你只要找到同源序列，对这个同源序列下功夫就行。我也是刚刚走出对引物设计的迷茫，有的还不是很透彻，只能给你一点建议：大胆细心的设计，不要怕错，多试。
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我不会！
4楼2013-11-10 21:30:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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★
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颜小泡泡: 金币+1, ★有帮助 2013-11-13 19:46:18
如果你的基因片段是完整的基因片段就不会有启动子和终止子不用再加。如果是ORF，那么就要就要加上终止子。PCR扩增出来的启动子之前的片段如果没有构成明显的破坏原来的SD sequence（比如与SD sequence明显的碱基配对二级结构的引物序列），或者构成的全新的SD sequence紧随其后会有新的位点适当地ATG位点出现，那么在原核细胞中表达应该没有问题，一般不会引起阅读框的改变。如果是在真核细胞中表达，则引物不要破坏原来的5'-UTR sequence和3'-UTR sequence就一般不会引起阅读框的改变。
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5楼2013-11-10 22:53:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

当然在真核细胞中表达时，PCR引物设计也不要破坏转录起点的initiator元件。
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6楼2013-11-10 22:55:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
颜小泡泡: 金币+1 2013-11-13 19:46:24
你扩增整个基因的目的是什么？如果是表达的话，要看是用native的启动子，还是用特定的启动子。如果用现有的表达载体做过表达的话，启动子终止子的序列都在表达载体上了，你不需要考虑的。如果你要用基因本身的启动子表达，做克隆的时候当然要包括启动子序列。如果你想用其它启动子表达，则需要单独克隆。
做基因表达时，设计下游引物是否带终止密码子要看你是否克隆到C端带标签的表达载体上。如果C端有标签融合，就需要设计引物到终止密码子前。如果C端不带tag，引物中要有终止密码子。
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7楼2013-11-11 02:20:32
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