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fengyunqb

新虫 (小有名气)

[求助] 引物设计区域选择问题

我设计兼并引物。多序列比对发现三个保守区。一个在中上游，一个在中游，一个在下游末。我准备选中上游和下游末分别设计上下游引物。但老师说选中游设计简并引物就可以了。有经验的朋友能告诉我我该选哪个保守区设计引物吗？设计多少对比较好？用来扩增未知基因保守区。

[ Last edited by 1949stone on 2012-8-20 at 07:49 ]
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1楼 2012-08-13 10:08:46
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心强我强

铜虫 (正式写手)
不懂，也想知道答案，帮顶。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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走过的路是平的，坚持自己所选择的。。。学会在暴雨中跳舞！
2楼2012-08-19 14:44:22
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lizt

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-20 13:51:57
fengyunqb: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-20 17:33:47
关键是看你的目的？
检测？克隆？
如果仅仅是检测的话，只要比较保守，应该是那个区域影响是不大。
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学如逆海行舟
3楼2012-08-20 00:36:18
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 心强我强 at 2012-08-19 14:44:22
不懂，也想知道答案，帮顶。

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。
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4楼2012-08-20 17:32:12
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lizt at 2012-08-20 00:36:18
关键是看你的目的？
检测？克隆？
如果仅仅是检测的话，只要比较保守，应该是那个区域影响是不大。

我是要做克隆的。我分别选取上下游六个保守区。设计三对引物。分别做。作对照。有什么好的建议吗。
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5楼2012-08-20 17:33:36
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lizt

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
fengyunqb: 金币+2, ★★★★★最佳答案, 哈哈，万分感谢。 2012-08-21 12:52:24
你仅仅知道氨基酸序列？或是其他物种的基因序列？
你目前的情况，兼并引物已经设计好，可以先试一下PCR，如果得到你的预期大小的片段，胶回收，连接T-vector，测序。
在做PCR扩增时，注意变换条件，特别是复性（退火）温度，开始的时候先从温度相对较低比如50-55度开始，多变几个温度，然后根据条带调整条件。
也可以用降落PCR，不用理会复性温度。
所用的核酸，DNA或者RNA一定要纯，最好用适量，一般1000-10000个拷贝比较合适。如果是RNA，最好用mRNA。
最后，祝你好运！
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学如逆海行舟
6楼2012-08-20 23:08:09
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lizt at 2012-08-20 23:08:09
你仅仅知道氨基酸序列？或是其他物种的基因序列？
你目前的情况，兼并引物已经设计好，可以先试一下PCR，如果得到你的预期大小的片段，胶回收，连接T-vector，测序。
在做PCR扩增时，注意变换条件，特别是复性（退 ...

求助，我是准备设计简并引物扩增一个鱼类的未知基因的保守区。一些文献上是提取脑部总RNA，然后反转录得到第一链CDNA,然后用这CDNA做模板扩增保守区。但是我老师的想法是直接提取DNA，然后用DNA做模板来扩增保守区。请问，这样可行否？各自的有缺点是什么？你有经验吗，有经验的话指点下，谢谢，我发了个这个问题的帖子。去帮我回答金币给你啊。
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7楼2012-08-24 16:16:07
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-08-24 16:16:07
求助，我是准备设计简并引物扩增一个鱼类的未知基因的保守区。一些文献上是提取脑部总RNA，然后反转录得到第一链CDNA,然后用这CDNA做模板扩增保守区。但是我老师的想法是直接提取DNA，然后用DNA做模板来扩增保守区 ...

直接用DNA做模版，会不会在你克隆的片段中存在内含子，所以最好使用RNA,再转录成CDNA.
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nothing isimpossible
8楼2012-09-01 17:29:19
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