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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计——下游引物是否需要考虑阅读框问题
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颜小泡泡

新虫 (初入文坛)

[求助] 引物设计——下游引物是否需要考虑阅读框问题

如题，本人是分子生物学小菜鸟一枚，最近刚学习如何设计引物，非常困惑。。。
请问大家，在设计上游引物的时候，起始密码子ATG的阅读框是要格外注意的，不能在加完酶切位点之后把阅读框破坏掉
那么下游引物是否需要考虑阅读框的问题呢？如果加完下游酶切位点，阅读框被破坏了，是否也需要补加碱基

还有，补加的碱基会不会影响目的基因所合成的蛋白质的表达呢。。

最后一个问题，下游引物是否需要考虑加入终止密码子呢，谢谢各位了！
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1楼 2013-11-10 16:41:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
颜小泡泡: 金币+1 2013-11-13 19:46:24
你扩增整个基因的目的是什么？如果是表达的话，要看是用native的启动子，还是用特定的启动子。如果用现有的表达载体做过表达的话，启动子终止子的序列都在表达载体上了，你不需要考虑的。如果你要用基因本身的启动子表达，做克隆的时候当然要包括启动子序列。如果你想用其它启动子表达，则需要单独克隆。
做基因表达时，设计下游引物是否带终止密码子要看你是否克隆到C端带标签的表达载体上。如果C端有标签融合，就需要设计引物到终止密码子前。如果C端不带tag，引物中要有终止密码子。
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7楼2013-11-11 02:20:32
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★ ★
amisking: 金币+2, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-11-10 18:43:00
首先根据你最后一个问题，说明你还没有明白PCR的机制，或者说是没有用自己的理解来消化。引物的设计不需要启动子和终止子，PCR产物的长短大小，完全取决于你设计的引物与目的DNA的同源型结合位点。
再来，你说上游别破坏了阅读框，那么下游也就不会破坏了，上下游引物是互补的两条链的引物，，，说的有点复杂，有问题可以线上继续讨论。
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我不会！
2楼2013-11-10 18:17:30
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颜小泡泡

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-11-10 18:17:30
首先根据你最后一个问题，说明你还没有明白PCR的机制，或者说是没有用自己的理解来消化。引物的设计不需要启动子和终止子，PCR产物的长短大小，完全取决于你设计的引物与目的DNA的同源型结合位点。
再来，你说上游 ...

谢谢回复

我的意思是，扩一整个基因的时候，基因自己会带启动子和终止子对吗，不用我额外再加了？
我知道上下游是互补的两条链的引物，但是我不明白，下游引物在扩增的时候，如果我的酶切位点和补加碱基不是3的倍数，会不会让基因错位
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3楼2013-11-10 19:41:48
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-10 22:59:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by 颜小泡泡 at 2013-11-10 19:41:48
谢谢回复

我的意思是，扩一整个基因的时候，基因自己会带启动子和终止子对吗，不用我额外再加了？
我知道上下游是互补的两条链的引物，但是我不明白，下游引物在扩增的时候，如果我的酶切位点和补加碱基不是3的 ...

说句实话，PCR引物的设计问题很微妙。如果按照引物设计原则设计出一个纸面上完美无暇的，在实际应用中往往就不一定好用，反之亦然。这对新手来说很头痛，很多情况下是根据经验而定。你的扩一整个基因？是说一个完整酶或者蛋白的编码基因吧？这个你只要找到同源序列，对这个同源序列下功夫就行。我也是刚刚走出对引物设计的迷茫，有的还不是很透彻，只能给你一点建议：大胆细心的设计，不要怕错，多试。
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我不会！
4楼2013-11-10 21:30:20
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