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园艺学童

铜虫 (小有名气)

[求助] miRNA提取和引物设计,想做实时定量检测下表达量 已有1人参与

最近想做有关miRNA的,不知道大家都是怎么提取的呀,听说用提取RNA的试剂盒也能提取,怎么纯化出来呢?
还有,引物大家都是怎么设计的啊,有软件么?内参怎么选得呢,植物,目前还米有数据库呢。。

[ Last edited by 园艺学童 on 2013-2-27 at 22:23 ]
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lizimin0322

新虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 应助指数-1, 违规存档, 非应助 2013-03-01 02:38:03
支持下!!为什么不和你的师兄导师好好地商量下~
3楼2013-02-28 09:55:49
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普通回帖

快乐的大脚

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
园艺学童: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-01 12:31:12
有很多提取RNA的试剂盒产品,有大量的也有小量的,可以根据需要选购。RTPCR引物设计的话两引物间要包含>200bp的内含子,引物长度约为18~24,TM值在55-65之间,FR引物克隆出来的片段在1000bp以内,引物特异性要求好。 希望对你有帮助~
2楼2013-02-28 09:20:18
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园艺学童

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lizimin0322 at 2013-02-28 09:55:49
支持下!!为什么不和你的师兄导师好好地商量下~

实验室我是第一个做的,导师也不会。。。
4楼2013-02-28 12:27:32
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园艺学童

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 快乐的大脚 at 2013-02-28 09:20:18
有很多提取RNA的试剂盒产品,有大量的也有小量的,可以根据需要选购。RTPCR引物设计的话两引物间要包含>200bp的内含子,引物长度约为18~24,TM值在55-65之间,FR引物克隆出来的片段在1000bp以内,引物特异性要求 ...

那就是是用什么软件设计的呢?
5楼2013-02-28 12:28:17
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damo8912

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
直接提总RNA就行吧
6楼2013-02-28 13:16:56
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happyboy_34

木虫 (著名写手)

…ing

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢详细的回答 2013-03-01 02:38:49
园艺学童: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-01 12:31:34
植物miRNA提取可用天根的植物miRNA提取试剂盒,可以同时提取总RNA(用于miRNA靶基因的定量分析)和小RNA(用于miRNA的定量分析)。
miRNA的定量通常有两种方法:
(1) 用Invitrongen或者Qiagen的miRNA定量试剂盒,试剂盒中包括一条通用引物,原理是将小RNA加上一段特异序列,其中包括与通用引物互补的一段序列,通过后续自己针对自己研究的miRNA设计的特异引物,这样就有了上下游引物用于miRNA的定量研究了;
(2) 用针对自己研究的miRNA特异设计的探针进行定量。

miRNA的引物也根据两种方法而分别设计、合成各自的引物即可,相关中英文文献都能查阅到。

我知道的就这些了,欢迎其他人补充。
真理无处不在,但却非唾手可得。
7楼2013-02-28 14:27:19
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快乐的大脚

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 园艺学童 at 2013-02-28 12:28:17
那就是是用什么软件设计的呢?...

不用 软件 知道自己的序列直接设计就可以按照上述要求 就行
8楼2013-03-01 07:32:23
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园艺学童

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 快乐的大脚 at 2013-03-01 07:32:23
不用 软件 知道自己的序列直接设计就可以按照上述要求 就行...

能详细讲下吗,我现在也已经知道了miRNA的序列,怎么直接设计?辛苦了!
9楼2013-03-01 08:26:28
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快乐的大脚

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 园艺学童 at 2013-03-01 08:26:28
能详细讲下吗,我现在也已经知道了miRNA的序列,怎么直接设计?辛苦了!...

你是通过miRNA沉默目的基因的表达吗 检测目的基因被沉默的程度 那么需要提总RNA  
知道目的基因的序列 在目的基因上找一段长度约为18~24的序列作为一端引物,另一端引物距离前一个引物1000bp以内,两引物之间跨过大于200bp的内含子,两引物TM值在55-65之间,然后把克隆的出的目的片段,跟基因库BLAST,来看引物克隆出来片段的序列特异性,要是特异性不好的话就重新选择序列,特异性不好会把其他的基因克隆出来,实验结果不准确。
10楼2013-03-04 08:55:56
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