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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » miRNA提取和引物设计，想做实时定量检测下表达量
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园艺学童

铜虫 (小有名气)

[求助] miRNA提取和引物设计，想做实时定量检测下表达量 已有1人参与

最近想做有关miRNA的，不知道大家都是怎么提取的呀，听说用提取RNA的试剂盒也能提取，怎么纯化出来呢？
还有，引物大家都是怎么设计的啊，有软件么?内参怎么选得呢，植物，目前还米有数据库呢。。

[ Last edited by 园艺学童 on 2013-2-27 at 22:23 ]
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1楼 2013-02-27 22:22:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lizimin0322

新虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 应助指数-1, 违规存档, 非应助 2013-03-01 02:38:03
支持下！！为什么不和你的师兄导师好好地商量下~
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3楼2013-02-28 09:55:49
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普通回帖

快乐的大脚

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
园艺学童: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-01 12:31:12
有很多提取RNA的试剂盒产品，有大量的也有小量的，可以根据需要选购。RTPCR引物设计的话两引物间要包含>200bp的内含子，引物长度约为18~24，TM值在55-65之间，FR引物克隆出来的片段在1000bp以内，引物特异性要求好。 希望对你有帮助~
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2楼2013-02-28 09:20:18
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园艺学童

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lizimin0322 at 2013-02-28 09:55:49
支持下！！为什么不和你的师兄导师好好地商量下~

实验室我是第一个做的，导师也不会。。。
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4楼2013-02-28 12:27:32
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园艺学童

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 快乐的大脚 at 2013-02-28 09:20:18
有很多提取RNA的试剂盒产品，有大量的也有小量的，可以根据需要选购。RTPCR引物设计的话两引物间要包含>200bp的内含子，引物长度约为18~24，TM值在55-65之间，FR引物克隆出来的片段在1000bp以内，引物特异性要求 ...

那就是是用什么软件设计的呢？
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5楼2013-02-28 12:28:17
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damo8912

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接提总RNA就行吧
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6楼2013-02-28 13:16:56
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happyboy_34

木虫 (著名写手)

…ing

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢详细的回答 2013-03-01 02:38:49
园艺学童: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-01 12:31:34
植物miRNA提取可用天根的植物miRNA提取试剂盒，可以同时提取总RNA(用于miRNA靶基因的定量分析)和小RNA(用于miRNA的定量分析)。
miRNA的定量通常有两种方法：
(1) 用Invitrongen或者Qiagen的miRNA定量试剂盒，试剂盒中包括一条通用引物，原理是将小RNA加上一段特异序列，其中包括与通用引物互补的一段序列，通过后续自己针对自己研究的miRNA设计的特异引物，这样就有了上下游引物用于miRNA的定量研究了；
(2) 用针对自己研究的miRNA特异设计的探针进行定量。

miRNA的引物也根据两种方法而分别设计、合成各自的引物即可，相关中英文文献都能查阅到。

我知道的就这些了，欢迎其他人补充。
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真理无处不在，但却非唾手可得。
7楼2013-02-28 14:27:19
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快乐的大脚

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 园艺学童 at 2013-02-28 12:28:17
那就是是用什么软件设计的呢？...

不用 软件 知道自己的序列直接设计就可以按照上述要求 就行
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8楼2013-03-01 07:32:23
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园艺学童

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 快乐的大脚 at 2013-03-01 07:32:23
不用 软件 知道自己的序列直接设计就可以按照上述要求 就行...

能详细讲下吗，我现在也已经知道了miRNA的序列，怎么直接设计？辛苦了！
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9楼2013-03-01 08:26:28
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快乐的大脚

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 园艺学童 at 2013-03-01 08:26:28
能详细讲下吗，我现在也已经知道了miRNA的序列，怎么直接设计？辛苦了！...

你是通过miRNA沉默目的基因的表达吗 检测目的基因被沉默的程度 那么需要提总RNA  
知道目的基因的序列 在目的基因上找一段长度约为18~24的序列作为一端引物，另一端引物距离前一个引物1000bp以内，两引物之间跨过大于200bp的内含子，两引物TM值在55-65之间，然后把克隆的出的目的片段，跟基因库BLAST,来看引物克隆出来片段的序列特异性，要是特异性不好的话就重新选择序列，特异性不好会把其他的基因克隆出来，实验结果不准确。
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10楼2013-03-04 08:55:56
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