应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问大片段怎么扩
51/1返回列表
查看: 1911  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Ever希夷

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问大片段怎么扩 已有9人参与

构建好了质粒，但是目的片段将近8000bp，这种大片段用LA taq酶一直扩不出来，请问怎么办？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验 Vectors contribution

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-07 19:03:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

通-仔

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有没有人做3'RACE 巢式PCR ?用的引物是简并引物，为什么我一直得不到条带？试剂盒有问题？但是对照能做出来我该怎么改进？求助。。。。谢谢
赞一下 回复此楼
6楼2014-07-08 22:08:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
advantage 2应该不成问题

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2014-07-07 19:25:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 09:00:17
长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
赞一下(3人) 回复此楼
3楼2014-07-08 01:51:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
更正：上贴的标题应为；“长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求”。
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-08 02:05:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭