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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀
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cathereen_li

新虫 (初入文坛)

[求助] 我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀 已有2人参与

我要扩增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，总是扩不出来，求大侠指点呀！！试过了各种办法，两步法也试过了，一开始用pfu酶，后来用taq酶，LA taq也用过了，都P不出来，用taqP出来了一个，但是大小不对。我的体系为25微升体系，程序与体系如下：94度，3分钟；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30个循环；72度8分钟。体系：上下游引物各一微升，模板视浓度而定，一般为2到5微升，buffer为2.5微升，dNTP为1.5微升，酶为1微升，补水到25微升。小女子论坛新手，金币不太足，还请各位大侠多多包涵~~~~
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1楼 2013-03-04 13:31:42
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-03-04 22:22:15
你提的RNA质量如何？反转录酶质量怎么样，能否扩增3kb的片段
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2楼2013-03-04 15:51:35
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爱逍遥

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
检测cDNA的质量如何，如果不行重新合成模板
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3楼2013-03-04 16:10:25
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haitian0625

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-04 22:22:07
刚用过pfu扩4kb，拙见：95度 5-10min; 95度 30'', 退火温度 30''-60'', 68度延伸 70''/80'', 35-40循环；68度 延伸6-8min. 引物浓度在10p即可。
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4楼2013-03-04 21:59:21
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cathereen_li

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by haitian0625 at 2013-03-04 21:59:21
刚用过pfu扩4kb，拙见：95度 5-10min; 95度 30'', 退火温度 30''-60'', 68度延伸 70''/80'', 35-40循环；68度 延伸6-8min. 引物浓度在10p即可。

谢谢您的回复！那您用的pfu酶是哪个公司生产的？我的是thermo家的
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5楼2013-03-06 20:58:30
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cathereen_li

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱逍遥 at 2013-03-04 16:10:25
检测cDNA的质量如何，如果不行重新合成模板

谢谢您的回复！请问如何检测cDNA的质量？测浓度？我设计引物时设计了我全长片段中的一小段片段的引物，每次用新合成的模板之前都要先用此模板P一下短片段，我认为，如果短片段能P出来，说明此模板中有我的目的基因。不知道这样想对不对
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6楼2013-03-06 21:00:56
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cathereen_li

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2013-03-04 15:51:35
你提的RNA质量如何？反转录酶质量怎么样，能否扩增3kb的片段

谢谢您的回复！想向您请教，该如何判断RNA质量？反转录试剂用的是北京全式金的的第一条链反转录试剂盒，能否扩增3kb的片段与反转录酶有着什么样的关系？
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7楼2013-03-06 21:03:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
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8楼2014-07-08 01:54:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正：上贴的标题应为；“长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求”。
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9楼2014-07-08 02:03:26
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引物设计的怎么样？这个不OK，用再好的酶都不行的，RNA怎么样，反转录一般问题不大，你要的基因表达量如果很低，cDNA就不稀释了直接扩。

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-07-08 12:38:20
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