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cathereen_li

新虫 (初入文坛)

[求助] 我要扩3kb的片段,人的GLDC基因,总是扩不出来,求大侠指点呀 已有2人参与

我要扩增3kb的片段,人的GLDC基因的cDNA,总是扩不出来,求大侠指点呀!!试过了各种办法,两步法也试过了,一开始用pfu酶,后来用taq酶,LA taq也用过了,都P不出来,用taqP出来了一个,但是大小不对。我的体系为25微升体系,程序与体系如下:94度,3分钟;94度,45秒,55度,40秒,72度3分半,30个循环;72度8分钟。体系:上下游引物各一微升,模板视浓度而定,一般为2到5微升,buffer为2.5微升,dNTP为1.5微升,酶为1微升,补水到25微升。小女子论坛新手,金币不太足,还请各位大侠多多包涵~~~~
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引物设计的怎么样?这个不OK,用再好的酶都不行的,RNA怎么样,反转录一般问题不大,你要的基因表达量如果很低,cDNA就不稀释了直接扩。

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2014-07-08 12:38:20
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流! 2013-03-04 22:22:15
你提的RNA质量如何?反转录酶质量怎么样,能否扩增3kb的片段
2楼2013-03-04 15:51:35
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爱逍遥

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
检测cDNA的质量如何,如果不行重新合成模板
3楼2013-03-04 16:10:25
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haitian0625

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-04 22:22:07
刚用过pfu扩4kb,拙见:95度 5-10min; 95度 30'', 退火温度 30''-60'', 68度延伸 70''/80'', 35-40循环;68度 延伸6-8min. 引物浓度在10p即可。
4楼2013-03-04 21:59:21
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