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cathereen_li

新虫 (初入文坛)

[求助] 我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀 已有2人参与

我要扩增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，总是扩不出来，求大侠指点呀！！试过了各种办法，两步法也试过了，一开始用pfu酶，后来用taq酶，LA taq也用过了，都P不出来，用taqP出来了一个，但是大小不对。我的体系为25微升体系，程序与体系如下：94度，3分钟；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30个循环；72度8分钟。体系：上下游引物各一微升，模板视浓度而定，一般为2到5微升，buffer为2.5微升，dNTP为1.5微升，酶为1微升，补水到25微升。小女子论坛新手，金币不太足，还请各位大侠多多包涵~~~~
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1楼 2013-03-04 13:31:42
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引物设计的怎么样？这个不OK，用再好的酶都不行的，RNA怎么样，反转录一般问题不大，你要的基因表达量如果很低，cDNA就不稀释了直接扩。

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-07-08 12:38:20
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-03-04 22:22:15
你提的RNA质量如何？反转录酶质量怎么样，能否扩增3kb的片段
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2楼2013-03-04 15:51:35
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爱逍遥

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
检测cDNA的质量如何，如果不行重新合成模板
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3楼2013-03-04 16:10:25
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haitian0625

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-04 22:22:07
刚用过pfu扩4kb，拙见：95度 5-10min; 95度 30'', 退火温度 30''-60'', 68度延伸 70''/80'', 35-40循环；68度 延伸6-8min. 引物浓度在10p即可。
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4楼2013-03-04 21:59:21
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