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PCR设计引物算Tm和CG含量的问题，help，help已有2人参与
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1，本人设计了一系列引物，引物的5端加了酶切位点和保护碱基，那在计算引物的Tm和CG时，要不要把酶切位点和保护碱基也算进去？ 2，还有就是为什么p不出目的片段啊，崩溃了，目的片段3.6kb长。跑了好久都没跑出来。退火温度已经从60降到47了，循环次数也已经从35加到40，昨天跑胶就只是出来2kb左右的片段。由于是要用来表达蛋白质的，所以扩目的片段的时候只能把目的片段完整的扩出来，所以引物的位置没得选，我所能做的只能改变引物的长度。 大神们，help |
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2楼2014-10-16 14:10:35
Allison_Sue
铁虫 (初入文坛)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
帆蚌侠(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-16 14:53:54
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帆蚌侠(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-16 14:53:54
| 以我自身实践提供点思路吧，前段时间也很挣扎。。。一般用PP5设计3，4对引物，看着评分还好，错配不多就可以，不用特别在意GC之类，按建议的Ta opt值增减2-3℃做个梯度肯定能P出来，都对了就是一次性就可以。如果一直做不行的话，说明可能你拿来设计的基因组就跟你实际菌的基因组有较大差别，换个编号的同菌种基因组试一试。也可能引物设计的不对，这个方面可以让师兄师姐帮你参考。不知道你延伸的时间设置的多少，如果用的taq DNA 聚合酶，延伸速度一般是一分钟1kb，那么你就至少得设4分钟，注意按你买的酶来设置延伸时间，不行换换聚合酶也是可以的。循环数一般30-35就够了。另外，保护碱基和内切酶位点碱基在计算Tm时不予考虑，我因为后续试验设计没有加酶切位点和保护碱基，你可以先直接PP看，P出来再加上酶切位点和保护碱基。 |
3楼2014-10-16 14:50:39