| 查看: 3885 | 回复: 2 | ||
[求助]
PCR设计引物算Tm和CG含量的问题，help，help 已有2人参与
|
|
1，本人设计了一系列引物，引物的5端加了酶切位点和保护碱基，那在计算引物的Tm和CG时，要不要把酶切位点和保护碱基也算进去？ 2，还有就是为什么p不出目的片段啊，崩溃了，目的片段3.6kb长。跑了好久都没跑出来。退火温度已经从60降到47了，循环次数也已经从35加到40，昨天跑胶就只是出来2kb左右的片段。由于是要用来表达蛋白质的，所以扩目的片段的时候只能把目的片段完整的扩出来，所以引物的位置没得选，我所能做的只能改变引物的长度。 大神们，help |
回复此楼» 猜你喜欢
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展
已经有1人回复
-
膀胱癌靶向治疗新选择：厄达替尼作用机制与耐药研究进展
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有110人回复
-
从水母到实验室：腔肠素的发现历程与生物发光奥秘
已经有1人回复
-
线粒体氧化磷酸化的新靶点：S-Gboxin的发现与研究进展
已经有0人回复
-
PROTAC药物开发选择VHL配体：MDK-7526以87%出口向量占有率成首选
已经有0人回复
-
MCC950：NLRP3炎症小体特异性抑制剂的科研应用与前景
已经有0人回复
-
康替唑胺研发17年：如何解决多重耐药菌感染难题
已经有0人回复
-
伊曲莫德（Etrasimod）从“肠道免疫失控”到精准靶向干预
已经有1人回复
-
西达本胺：创新HDAC抑制剂的抗肿瘤之路
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 设计引物Tm值过高？？？
已经有7人回复
- PCR引物设计问题，求教大神~
已经有11人回复
- 用基因组DNA进行PCR怎么设计引物啊
已经有10人回复
- PCR引物退火温度怎么计算？
已经有3人回复
- PCR引物GC含量过低时候，如何调整PCR体系？
已经有6人回复
- PCR上下游引物TM值相差一般多少
已经有5人回复
- PCR引物的量如何确定，求助高手指教
已经有11人回复
- PCR-DGGE的引物设计
已经有5人回复
- PCR引物设计的问题
已经有8人回复
- 1.5kb的 PCR目的序列GC含量高达67%，引物Tm值达90℃，怎么P比较好？
已经有16人回复
- 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助
已经有17人回复
- 【求助/交流】引物设计信息如此，touchdownPCR如何设计？
已经有7人回复
- 【求助/交流】pCR引物设计的详细规则
已经有7人回复
- 【求助/交流】PCR引物可否不用设计直接用参考文献中的？
已经有7人回复
2楼2014-10-16 14:10:35
Allison_Sue
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 38.7
- 帖子: 20
- 在线: 5.8小时
- 虫号: 3257225
- 注册: 2014-06-05
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
帆蚌侠(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-16 14:53:54
感谢参与，应助指数 +1
帆蚌侠(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-16 14:53:54
| 以我自身实践提供点思路吧，前段时间也很挣扎。。。一般用PP5设计3，4对引物，看着评分还好，错配不多就可以，不用特别在意GC之类，按建议的Ta opt值增减2-3℃做个梯度肯定能P出来，都对了就是一次性就可以。如果一直做不行的话，说明可能你拿来设计的基因组就跟你实际菌的基因组有较大差别，换个编号的同菌种基因组试一试。也可能引物设计的不对，这个方面可以让师兄师姐帮你参考。不知道你延伸的时间设置的多少，如果用的taq DNA 聚合酶，延伸速度一般是一分钟1kb，那么你就至少得设4分钟，注意按你买的酶来设置延伸时间，不行换换聚合酶也是可以的。循环数一般30-35就够了。另外，保护碱基和内切酶位点碱基在计算Tm时不予考虑，我因为后续试验设计没有加酶切位点和保护碱基，你可以先直接PP看，P出来再加上酶切位点和保护碱基。 |
3楼2014-10-16 14:50:39