| 查看: 2089 | 回复: 9 | ||||
cathereen_li新虫 (初入文坛)
|
[求助]
我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀 已有2人参与
|
| 我要扩增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，总是扩不出来，求大侠指点呀！！试过了各种办法，两步法也试过了，一开始用pfu酶，后来用taq酶，LA taq也用过了，都P不出来，用taqP出来了一个，但是大小不对。我的体系为25微升体系，程序与体系如下：94度，3分钟；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30个循环；72度8分钟。体系：上下游引物各一微升，模板视浓度而定，一般为2到5微升，buffer为2.5微升，dNTP为1.5微升，酶为1微升，补水到25微升。小女子论坛新手，金币不太足，还请各位大侠多多包涵~~~~ |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有55人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- PCR设计引物算Tm和CG含量的问题，help，help
已经有2人回复
- 【原创】原创之六：环境样品总DNA的提取与纯化【已搜索无重复】
已经有178人回复
- 从基因组上pcr扩增长片段
已经有0人回复
- 【专题】PCR实验技术指南
已经有535人回复
2楼2013-03-04 15:51:35
3楼2013-03-04 16:10:25
haitian0625
金虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 1392.4
- 帖子: 123
- 在线: 56.9小时
- 虫号: 903890
- 注册: 2009-11-15
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
4楼2013-03-04 21:59:21
cathereen_li
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 185.1
- 散金: 20
- 帖子: 45
- 在线: 22小时
- 虫号: 1672126
- 注册: 2012-03-07
- 专业: 细胞生物学
5楼2013-03-06 20:58:30
cathereen_li
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 185.1
- 散金: 20
- 帖子: 45
- 在线: 22小时
- 虫号: 1672126
- 注册: 2012-03-07
- 专业: 细胞生物学
6楼2013-03-06 21:00:56
cathereen_li
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 185.1
- 散金: 20
- 帖子: 45
- 在线: 22小时
- 虫号: 1672126
- 注册: 2012-03-07
- 专业: 细胞生物学
7楼2013-03-06 21:03:26
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
|
长片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) |
8楼2014-07-08 01:54:51
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
9楼2014-07-08 02:03:26
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
10楼2014-07-08 12:38:20
100