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cathereen_li新虫 (初入文坛)
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我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀 已有2人参与
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| 我要扩增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，总是扩不出来，求大侠指点呀！！试过了各种办法，两步法也试过了，一开始用pfu酶，后来用taq酶，LA taq也用过了，都P不出来，用taqP出来了一个，但是大小不对。我的体系为25微升体系，程序与体系如下：94度，3分钟；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30个循环；72度8分钟。体系：上下游引物各一微升，模板视浓度而定，一般为2到5微升，buffer为2.5微升，dNTP为1.5微升，酶为1微升，补水到25微升。小女子论坛新手，金币不太足，还请各位大侠多多包涵~~~~ |
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2楼2013-03-04 15:51:35
3楼2013-03-04 16:10:25
haitian0625
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7楼2013-03-06 21:03:26
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【答案】应助回帖
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长片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) |
8楼2014-07-08 01:54:51
凌波丽
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9楼2014-07-08 02:03:26
Neo2000
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10楼2014-07-08 12:38:20
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