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cathereen_li

新虫 (初入文坛)

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[求助] 我要扩3kb的片段，人的GLDC基因，总是扩不出来，求大侠指点呀已有2人参与

我要扩增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，总是扩不出来，求大侠指点呀！！试过了各种办法，两步法也试过了，一开始用pfu酶，后来用taq酶，LA taq也用过了，都P不出来，用taqP出来了一个，但是大小不对。我的体系为25微升体系，程序与体系如下：94度，3分钟；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30个循环；72度8分钟。体系：上下游引物各一微升，模板视浓度而定，一般为2到5微升，buffer为2.5微升，dNTP为1.5微升，酶为1微升，补水到25微升。小女子论坛新手，金币不太足，还请各位大侠多多包涵~~~~

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1楼 2013-03-04 13:31:42

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凌波丽

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【答案】应助回帖

长片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)