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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 2.3kb 大片段pcr 求赐教
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hailey

银虫 (小有名气)

[求助] 2.3kb 大片段pcr 求赐教 已有4人参与

请路过的虫友大神们看看，我的片段是2.3kb的，GC 含量是59.61%  ，所以就没用GC buffer 。
所用PCR体系25ul  ,
10*transtart buffer 2.5ul
transtart Taq  ase    0.5ul
dNTPs  1ul
primer1  1ul
primer    1ul
cDNA   2ul
dd 水  17ul  

95度 5min
94度 30s
51度 -61度  设置梯度 各30s
72度 2.5min
72度 10min
35个循环

没有P出来目的条带，什么都没有，本想上传图片的，网络不好没有上传成功

求赐教
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时刻为梦想而战！！
1楼 2014-06-02 00:19:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

王小七wq

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-04 19:56:51
我之前也扩增2kd左右片段，退火温度55度，90s，也可适当的提高温度至58度，90s，25或30个循环，别的条件和你基本一致，扩增出目的条带。如果条件许可，你可以换聚合酶，phusion甚至是Q5。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

hailey
12楼2014-06-03 15:47:44
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-02 23:39:58
1.拿内参基因的引物扩增下看看你的cDNA质量咋样~
2.如果杂带太多那就是你的PCR条件不适合或者你设计的引物不好。
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大家相互帮助哈
7楼2014-06-02 21:36:31
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普通回帖

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-02 10:49:45
换cDNA模板。
2.3k不大，cDNA模板质粒不高通常是P不出来的原因。另外，cDNA是有组织特异性的，你的基因确定在这个组织或细胞系中有比较高的表达？
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2楼2014-06-02 07:34:15
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-02 07:34:15
换cDNA模板。
2.3k不大，cDNA模板质粒不高通常是P不出来的原因。另外，cDNA是有组织特异性的，你的基因确定在这个组织或细胞系中有比较高的表达？

嗯嗯。。。是有高表达的，可以查到相关文献的，今天准备加10* GC  enhanger 试试..
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时刻为梦想而战！！
3楼2014-06-02 09:12:30
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BioChen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hailey at 2014-06-02 09:12:30
嗯嗯。。。是有高表达的，可以查到相关文献的，今天准备加10* GC  enhanger 试试.....

之前的回答，打错字了，囧
是cDNA质量不高
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4楼2014-06-02 09:19:40
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-02 09:19:40
之前的回答，打错字了，囧
是cDNA质量不高...

还是没有目的条带，有较明显的条带，但不是我想要的，杂带还是多。。。
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时刻为梦想而战！！
5楼2014-06-02 15:15:05
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BioChen

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-02 23:39:41
引用回帖:
5楼: Originally posted by hailey at 2014-06-02 15:15:05
还是没有目的条带，有较明显的条带，但不是我想要的，杂带还是多。。。...

学会自己分析原因。
1、若目的条带完全没有，换模板，换引物，换酶等等
2、若目的条带很弱，切胶回收，多做几管PCR，应该能满足量的要求。还有就是优化PCR条件以增加目的条带，减弱杂带。
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6楼2014-06-02 17:31:40
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hailey at 2014-06-02 15:15:05
还是没有目的条带，有较明显的条带，但不是我想要的，杂带还是多。。。...

提高退火温度
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借口很贱，，，
8楼2014-06-02 22:46:33
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hailey

银虫 (小有名气)
退火温度已经提高到 71度了，还是没有目的条带…   我自己都被搞无语啦…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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时刻为梦想而战！！
9楼2014-06-02 22:58:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hailey: 金币+5, ★有帮助 2014-06-03 19:04:13
引用回帖:
9楼: Originally posted by hailey at 2014-06-02 22:58:20
退火温度已经提高到 71度了，还是没有目的条带…   我自己都被搞无语啦…

我晕，你都快赶上延伸温度了这能行？？你的引物这么高温度可能都不和模板结合
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大家相互帮助哈
10楼2014-06-03 02:12:09
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