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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3个片段的重叠pcr能否一步到位？
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hackett

银虫 (小有名气)

[求助] 3个片段的重叠pcr能否一步到位？

有三个片段，分别为330 150 250bp，两个接头都有20bp的重叠序列，想一次性拼起来。PCR时分步进行，先是不加引物，单纯扩模板。希望得到三个片段正确连接的模板。然后加入第一个片段的上游引物和第三个片段的下游引物，做了好几次了，之前都会出现250bp的条带，又一次在目的条带大小处有点模糊的亮区，但是比250bp处的条带暗很多。最后一次什么条带都没了。
拼模板时的退火温度试过55至40℃的梯度，和40到30℃的touchdown，都是10个循环，后面加入引物的扩增试过50-68℃的梯度，都没有能成功。我自己觉得问题主要处在3片段的模板没有连出来。不知道有没有人遇到过类似的情况？该怎么解决？
关于出现250bp的非目的条带，怀疑是单引物扩增，引物第三个片段刚好也是250bp的样子。不知道这种情况在不跟换引物的前提下还能不能做下去？
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Dreamer
1楼 2012-04-15 15:51:06
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-16 21:32:58
可以的。拼接的时候把循环增加到60个循环。（分别扩增出三个片段后，纯化后等摩尔比加入重叠体系，然后进行重叠拼接）
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2楼2012-04-16 09:19:50
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hackett

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-04-16 09:19:50:
可以的。拼接的时候把循环增加到60个循环。（分别扩增出三个片段后，纯化后等摩尔比加入重叠体系，然后进行重叠拼接）

三个片段已经分别扩增了，您的意思是重叠拼接拼模板的循环数加到60吗？
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Dreamer
3楼2012-04-16 17:25:41
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hackett at 2012-04-16 17:25:41:
三个片段已经分别扩增了，您的意思是重叠拼接拼模板的循环数加到60吗？

是的
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4楼2012-04-16 19:15:56
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hackett

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-04-16 19:15:56:
是的

好的，下回我试试看。
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Dreamer
5楼2012-04-16 20:33:40
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 西瓜斑斑辛苦 2012-04-17 13:41:32
我们实验室摸索过一段时间，发现3个片段一次性连的话很困难，成功率很低，所以我们后面都改成一次连2个片段啦。
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6楼2012-04-16 21:34:55
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-17 13:41:56
可以 实验室有成功的先例 只是不是很好做  
买了试剂盒 fast pcr clone kit  据说很好连 打算试试
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7楼2012-04-16 22:27:58
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hackett

银虫 (小有名气)
两个确实比较好连，之前我也是两个连的，但是最后得到的长片段发现单酶切检验出问题了。不是目的片段，所以才不得不重新三个一起连。
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Dreamer
8楼2012-04-16 23:05:18
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hackett

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-04-16 22:27:58:
可以 实验室有成功的先例 只是不是很好做  
买了试剂盒 fast pcr clone kit  据说很好连 打算试试

thanks
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Dreamer
9楼2012-04-16 23:06:20
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chibang1220

木虫 (著名写手)
好像不大好做啊，
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人的差别在于业余时间
10楼2012-04-17 10:38:34
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