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3个片段的重叠pcr能否一步到位？
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有三个片段，分别为330 150 250bp，两个接头都有20bp的重叠序列，想一次性拼起来。PCR时分步进行，先是不加引物，单纯扩模板。希望得到三个片段正确连接的模板。然后加入第一个片段的上游引物和第三个片段的下游引物，做了好几次了，之前都会出现250bp的条带，又一次在目的条带大小处有点模糊的亮区，但是比250bp处的条带暗很多。最后一次什么条带都没了。 拼模板时的退火温度试过55至40℃的梯度，和40到30℃的touchdown，都是10个循环，后面加入引物的扩增试过50-68℃的梯度，都没有能成功。我自己觉得问题主要处在3片段的模板没有连出来。不知道有没有人遇到过类似的情况？该怎么解决？ 关于出现250bp的非目的条带，怀疑是单引物扩增，引物第三个片段刚好也是250bp的样子。不知道这种情况在不跟换引物的前提下还能不能做下去？ |
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